组织培养技术.doc
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组织培养技术组织培养的定义:组织培养:细胞、组织或器官→离体→合适的培养液、温度、无菌→使之生存和生长根据培养物的不同,组织培养又可分:细胞培养、组织培养和器官培养。二、组织培养的应用:优点:(1)研究对象是活细胞,可长时间动态观察细胞的形态结构和生命活动。(2)研究对象广泛,包括各种组织细胞。(3)可研究各种理化因素(温度、药物、毒素等)对细胞代谢、增殖、分化的影响。(4)研究方法多样,如倒置、荧光、电子显微镜、组织化学、同位素标记等,研究结果便于观察记录。应用:病毒学:细胞培养是分离培养病毒的重要手段,用于病毒感染的诊断,生产病毒苗。免疫学:杂交瘤-单克隆抗体技术。遗传学:从子宫取得胎儿细胞做染色体分析,进行遗传学诊断,试管婴儿等。肿瘤学:抗肿瘤药物筛选。不足之处:体外与体内培养条件不完全相同,失去神经内分泌系统的调节作用,培养的细胞存在一定的差异,故对结果的判断应慎重。培养细胞的特性:培养细胞的分型(按生长方式分)(1)贴附型:大部分细胞附着于支持物表面生长,分化不明显,形态单一,常反映其胚层起源。如上皮细胞型,成纤维细胞型,多形细胞型。(2)悬浮型:不贴附于支持物上,而呈悬浮状态生长,细胞呈圆形,单个或细胞团排列;见于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞培养细胞的生长和增殖:原代培养(PrimaryCulture):从体内取出组织开始在体外培养,在其传代之前。传代培养(Subculture):将细胞分离成两部分获更多至新的培养器皿中,并补充更新培养液。细胞系(Cellline):原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。细胞系的生长过程:原代培养期:1-4周,与体内细胞相似,但分裂不旺盛,含细胞类型较多。传代期:持续时间最长,细胞分裂增殖旺盛,保留原组织细胞的很多特征,一般传代30-50次后,细胞增殖逐渐缓慢。衰退期:细胞增殖缓慢,并逐渐停止,细胞形态轮廓增强,最后衰退、死亡。培养细胞的生长条件:1、营养需要:碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素2、生存环境:1)、温度:35℃-37℃耐低温不耐高温2)、PH值:7.2-7.4宁酸勿碱3)、气相:O2、CO2(5%)NaHCO3-CO24)、渗透压:260-320mmol/L3.无污染及无毒:防止污染要注意防止微生物(细菌、病毒、真菌、支原体等)的污染、不同细胞类型的交叉污染。出现以下情况时培养细胞可能有污染:1)培养液的酸碱度异常改变,如短期内颜色变黄;2)培养液出现混浊;3)光镜观察到大量颗粒或菌丝;4)细胞生长停止或出现死亡。组织培养的常用设备1.仪器包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保存的设备,如无菌室、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒置显微镜、离心机、液氮容器等2.器皿培养瓶培养皿培养板3.试剂(1)天然培养基:动物血清(如胎牛血清、小牛血清)。(2)合成培养基:如RPMI1640、DMEM、199等。多采用合成培养基+天然培养基(5-20%)。(3)平衡盐溶液:由无机盐和葡萄糖组成,用于洗涤、配液、维持渗透压,调节PH值等,如PBS、Hank’s等。(4)消化液:用于消化解离组织块,使贴壁细胞从附着物脱离。如胰酶、EDTA、胶原酶等。基本培养技术1.)无菌操作2.)取材3.)组织分离4.)原代培养5.)传代培养6.)细胞冻存与复苏1.无菌操作:防止污染是决定组织培养成败的关键,必须无菌操作!(1)培养前的消毒灭菌待用物品:洗涤、消毒灭菌。无菌室:紫外线照射30-50min,新洁尔灭拖地。超净台:75%酒精擦洗,紫外线灭菌等照射30min。(2)洗手和着装彻底洗手,着清洁工作服,酒精消毒手。(3)无菌培养操作超净台内操作,点燃酒精灯,火焰附近操作,在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。不直接用手触及器皿的无菌部分,如瓶口、瓶塞内侧,必要时借助镊子。吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能混用。转移液体时,吸管口不能触及瓶口,以防交叉污染。饭盒、瓶子不要过早打开,使用后及时盖好,瓶塞倒置在桌面。面向操作台时勿大声讲话、咳嗽,以免喷出唾沫,污染工作台面。操作完毕,整理台面,酒精擦拭。2.取材:新鲜、无菌、避免有害因素损伤。3.组织分离(1)离心分离:用于血液、羊水、胸水、腹水等悬液,500-1000rpm低速离心5-10min。(2)机械分离:用剪刀将组织剪切成小块,也可再挤压通过筛网,用于纤维成分少的组织,如脑、胚胎、一些肿瘤组织。(3)消化分离:用消化液使组织松散、细胞分开,获得细胞悬液。常用