134中国微生态学杂志2000年6月第12卷第3期ChineseJournaryofMicroecology,June2000,Vol12No3文章编号:1005-376X(2000)06-0134-02【丽珠专栏】提高双歧杆菌活菌制剂常温贮存稳定性的实验研究李丽华,杨章汉,雍学安,刘敏,钟群容(珠海丽珠集团丽珠生物工程制药厂,广东珠海519000)摘要:以DM8504青春双歧杆菌为实验菌株,对活菌制剂常温保存的稳定性问题进行探讨。首先对菌种进行耐温耐氧驯化试验,然后进行双歧杆菌菌体冻干过程中加入适宜保护剂试验。结果双歧杆菌活菌制剂常温保存的稳定性显著提高。经常温贮存270d后检测,质量符合规定。关键词:双歧杆菌活菌制剂;常温贮存;稳定性.中图分类号:R37文献标识码:A双歧杆菌为严格厌氧菌,对环境中的氧气和温1.2.1.1DM8504菌株耐氧性能的测定将充分度特别敏感。该特性决定了双歧杆菌活菌制剂对贮活化的DM8504菌株接种于改良BS固体平板上,存环境中接触的氧气和温度特别敏感。若不隔绝空置厌氧培养箱中,分别采用以下四种方式培养:气且在常温下贮存时,其活菌数很快下降,即常温贮a.抽真空,接着充满氮气,之后再抽真空,最后存稳定性较差。从目前情况看,国内多数双歧杆菌活充满混合气。菌制剂没有很好解决常温保存稳定性差的难题。对b.抽真空,充混合气1次。活菌制剂而言,活菌数的高低直接影响其效果,而且c.只抽真空,不充气。活菌制剂作为药品,经过生产销售各个环节才能到d.需氧培养。达患者手中,大部分时间是处于常温环境中。因此,37℃培养72h后,a.长了典型双歧杆菌菌落;双歧杆菌活菌制剂药品的常温稳定性对其药效有重b.生长很差;c、d.均无菌落生长。大影响。故要提高双歧杆菌活菌制剂药效,必须提高将活化菌种接种于牛奶培养基中,37℃,72h,其常温保存的稳定性。由于菌种本身的特性,双歧杆未发生凝乳。由此说明DM8504菌为严格厌氧菌。菌活菌制剂常温稳定性的提高必定依赖于菌种耐性1.2.1.2驯化过程a.将DM8504菌接种于改良(尤其是耐温耐氧性能)的提高。故此,本研究首先对BS培养基加10%牛奶中,抽气换气一次,37℃,培DM8504青春双歧杆菌进行了长期的耐温耐氧驯化养24h。工作。b.将a培养物转接种于改良BS培养基加10%另外,由于双歧杆菌活菌制剂生产中的原料菌牛奶中,抽气换气一次,37℃,培养24h。粉的生产采用真空冷冻干燥法,冻干过程可能对菌c.将b培养物转接种于改良BS培养基加10%体产生不同程度的损伤,影响菌体的生存能力。因牛奶中,抽真空后37℃,培养24h。此,要提高活菌制剂的常温稳定性,还必须把冻干过多次重复a、b、c过程后,再将菌株转入改良BS程对活菌的不良损伤尽可能减少。通过在活菌菌体培养基加10%牛奶,抽真空后培养到需氧培养交替的冻干过程中加入适宜的保护剂,可以达到减少甚重复多次后,可见于改良BS培养基加10%牛奶中至避免菌体冻干损伤、提高活菌存活率和收率的目培养14～20h后试管壁呈点状凝乳现象,逐渐减少的,本研究对此亦进行了探讨。牛奶量至仅用改良BS培养基需氧生长良好。1材料与方法1.2.1.3耐氧试验1.1材料实验菌种DM8504青春双歧杆菌,由a.将驯化菌接种于10%脱脂牛奶中,37℃培养本厂菌种保藏室提供。改良BS培养基、稀释液、活18～24h发生凝乳。菌计数平板、10%脱脂奶液等。厌氧培养箱:浙江义b.将驯化菌接种于改良BS培养基斜面上,乌冷冻机厂制造。恒温水浴锅。混合气体和氮气:珠37℃厌氧培养48h后置0～4℃冰箱保存,观察菌体海特种气体公司生产。冻干保护剂。存活情况。1.2方法1.2.1.4耐氧驯化菌株的鉴定及形态学观察。1.2.1DM8504菌种的耐氧驯化a.比较驯化菌株和原始菌株于改良BS平板上收稿日期:1999-08-20中国微生态学杂志2000年6月第12卷第3期ChineseJournalofMicroecology,June2000,Vol12No3135生长的菌落,两者相似;分别将二者的菌落涂片镜检～4℃有氧保藏由5d提高到60d后仍存活。后观察,菌体形态相似。表1驯化双歧杆菌菌株与原始菌株的耐氧性能比较耐氧性能耐温性能b.鉴定:用气相色谱测定代谢产物并进行生化菌种牛奶℃有改良液生长良好的斜面于时名称10%37BS10min鉴定,经驯化的菌株其特性与DM8504青春双歧杆氧培养18～24h体有氧培养0～4℃有氧保藏致死温度菌相符。原始菌种不发生凝乳生长很差保存5d后死亡60℃驯化菌株发生凝乳生长良好保存60d后仍存活63℃1.2.2菌株的耐温驯化2.2双歧杆菌活菌制