单克隆抗体制备实验过程单克隆抗体制备实验过程单克隆抗体制备实验过程单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射.抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官,刺激相应B淋巴细胞克隆,使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。说明：FCA，弗氏完全佐剂;FIA，弗氏不完全佐剂;Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6—8个点为宜。2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合,否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平.二、细胞融合(Cellfusion）【材料和试剂】（1)骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞,制备细胞悬液。（2)免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3～5min.无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织,将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清,再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0。5～2×108个脾细胞。饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管.右手固定注射器,使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清.先用5mlHAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml,备用。主要试剂的配制①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI—1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。不完全RPMI—1640培养基：RPMI—1640培养基原液96ml100×L。G.溶液1ml双抗溶液1ml7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全DMEM培养基：DMEM13。37g超纯水或四蒸水980mlNaHCO33.7g双抗溶液10ml100×L.G。溶液10ml用1NHCl调试PH至7.2-7。4，过滤除菌,分装4℃保存。完全RPMI—1640或DMEM培养基：不完全RPMI—1640或DMEM培养基80ml小牛血清15-20mlHT或HAT培养基：HT培养基HAT培养基完全RPMI—1640或DMEM培养基99ml98mlHT贮存液1ml1mlA贮存液1ml②氨基喋呤（A）贮存液（100×,4×10—5mol/L）称取1。76mg氨基喋呤（AminopterinMW440。4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌,分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存.③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT）贮存液(100×,H:10—2mol/L，T：1。6×10-3mol/L）称取136.1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW136。1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW242。2），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶），-20℃冻存.用前可置37℃加温助溶。④L—谷氨酰胺(L.G.）溶液(100×，0。2mol/L)称取2.92gL—谷氨酰胺(L-glutamine，MW146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解,过滤除菌，分装小瓶（4—5ml/瓶），—20℃冻存。⑤青、链霉素（双抗)溶液（100×）取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐）1g,溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4—5ml/瓶)，—20℃冻存。⑥7。5％NaHCO3溶液称取分析纯NaHCO37.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌,分装