会计学一、动物(dòngwù)免疫（3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫3天后，去脾脏融合对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体程序(chéngxù)依抗原性质而定。可溶性蛋白（提取或表达的蛋白）50-100μg颗粒(kēlì)性蛋白（病毒）50-100μg细菌106CFU活细胞（哺乳动物细胞）105-7CFU活癌源细胞104-6CFU糖类（多糖、糖蛋白）100-200μg核酸100-200μg1在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以MEM培养基复苏，37℃CO2培养箱中培养2在对数生长期收获107-108CFU的SP2/0细胞3500g离心5min，弃上清4轻轻振动(zhèndòng)离心管以松动细胞，重悬于20mLMEM营养液中注意要点：1如细胞外观不健康，或生长密度不好，应检测是否有支原体污染2一次用一个冻存管里的细胞融合(rónghé)，应避免长期培养3融合(rónghé)的细胞要处于对数生长期三、饲养(sìyǎng)细胞的制备5轻轻挤压小鼠腹腔(fùqiāng)，并用注射器来回抽吸几次，将小鼠腹腔(fùqiāng)内的巨噬细胞吸出，置细胞瓶内待用6将饲养细胞转至50mL离心管内，500g离心5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培养瓶内待用注意事项：1严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2吸取(xīqǔ)腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否则会造成污染3如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的位置，重新吸取(xīqǔ)细胞液四、脾细胞(xìbāo)的制备5用针头刺破脾脏(pízàng)，并用弯针头挤压脾脏(pízàng)，将脾细胞分离出来6用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离心管中，沉降5min7将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心5min，弃上清，沉淀以20mLMEM培养基重悬注意事项：1严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心，不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破3如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，应选(yīnɡxuǎn)用备用小鼠的脾脏五、细胞融合及培养(péiyǎng)5在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至37℃的MEM培养基加至融合管中37℃水浴5min室温下500g离心10min，弃上清在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉淀(chéndiàn)悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加入HAT培养基30mL，后加入10-15mL饲养细胞悬液9将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔2-3滴，约0.1-0.15mL10将细胞培养板置37℃饱和湿度的CO2培养箱中培养11培养3天后可取出细胞板在倒置(dàozhì)显微镜下观察细胞融合情况12培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2137-8天用HT培养基换液，全部换液1410-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，细胞上清变黄，可以检测(jiǎncè)融合细胞上清里的抗体。注意事项：1脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在2：1—5：1最好2细胞融合是关键步骤，避免用力吸打3细胞融合后3天要注意检查(jiǎnchá)是否污染，包括细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去4换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸出或冲散六、杂交瘤细胞(xìbāo)的筛选注意事项：1因单抗是鼠源的，故酶标记(biāojì)抗抗体常用酶标羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗体。如单用酶标记(biāojì)抗IgG抗体，则IgM类单抗就不能被筛选出来。2阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长满后，上清再检测一次3筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选特异单抗的方法最好1在克隆的前一天，准备数块含有0.1mL饲养细胞的96孔板2将24孔板里的待克隆细胞悬浮，取0.1mL细胞悬液加入(jiārù)0.9mL台盼蓝染色液，混匀3血液计数板计数4在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行10倍比稀释5当稀释至100CFU/mL时，取1mL细胞悬液至装有10mLHT培养基的瓶中，再分别加至96孔板中（预先加有饲养细胞），0.1mL/孔6将细胞培养板置37℃饱和湿度的CO2培养箱中培养10天左右，注意观察(guānchá)7大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7天换液一次，810天左右克隆长满，可以检测上清注意事项：1上清液要在24h内测定2细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞为深蓝色，且没有(méiyǒu)光泽3如有高质量的FCS，可不用饲养细胞4一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定5如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加1mol/mL的CuSO4溶液七、实验室规模抗体(kàngtǐ)制备体内生产腹水