生物化学技术原理及应用第八章基因重组与基因分析第一节核酸的分离纯化检测第一节核酸的分离纯化检测第一节核酸的分离纯化检测保持防止核酸的生物降解RNA酶抑制剂。RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。皂土。皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。DEPC（二乙基焦碳酸盐）。粘性液体，强核酸酶抑制剂作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。剧毒。其它：肝素、复合硅酸盐、RNase阻抑蛋白、氧钒核糖核苷复合物。第一节核酸的分离纯化检测2.核酸提取的过程与原理细胞的破碎细胞破碎的方法有：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法（SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等）。该过程要在低温下进行，并避免核酸酶对核酸的水解。核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力（核酸与碱性蛋白的结合）、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。核蛋白有核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白两种，针对所提核酸的种类，要选择合适的方法。核蛋白的解聚、变性蛋白的去除常用方法：加入浓盐溶液（如NaCl）。核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；酚/氯仿抽提。酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。可加上一定量的异戊醇可防止起泡和促使水相与有机相的分离（酚:氯:异戊醉=25:24:1）。核酸的沉淀浓缩核酸和蛋白质分离后，经离心后溶液分为三层：上中下分别是核酸溶液、变性蛋白质凝胶和氯仿。接下来要浓缩核酸，沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀的具体方法见第二章。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。核酸的纯化得到核酸沉淀后，还要要去除盐类，有机剂等杂质。通常是用乙醇洗涤，由于乙醇易挥发，最后只剩下比较纯的核酸。核酸的浓度与纯度的测定紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。结论：在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40μg/ml。测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。核酸的浓度与纯度的测定紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量测RNA纯RNA样品其OD260/OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。若RNA样品OD260/OD280比值太小，有蛋白质或酚污染；比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。溴乙锭荧光法测定核酸的含量如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。此法的比较主要基于目测，是估计水平。电泳检测核酸的含量和质量通过电泳，可以观察所得核酸样品降解情况，也可以通过与标准Marker亮度比较来估计所得核酸含量。核酸的保存DNADNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；长期保存样品中可加入一滴氯仿。RNARNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存；长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。第一节核酸的分离纯化检测3.植物总DNA的提取注意事项：选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀