实验二蛋白质得显色反应一、实验目得1、了解构成蛋白质得基本结构单位及主要连接形式．2、了解蛋白质与某些氨基酸得呈色反应原理。3、学习几种常用得鉴定蛋白质与氨基酸得方法。二、呈色反应1、双缩脲反应（1)原理:尿素加热至１８0oC左右,生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性条件下能与Ｃu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似,也能发生此反应(二肽与氨基酸都不能发生双缩脲反应）。可用于蛋白质得定性或定量测定。反应式如下:双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键得物质所有,含有一个肽键与一个-CS-NH２,—ＣＨ2—NＨ2,-CＨＲ-NH2，-CＨ2—ＮH2-ＣH-ＮH2－CＨ2-OH或—ＣＨOHＣH２ＮH2等基团得物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。NH3也干扰此反应,因为NＨ３与Cu2+可生成暗蓝色得络离子Ｃu(ＮH３)４２+。因此,一切蛋白质或二肽以上得多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应得物质不一定都就是蛋白质或多肽．（2)试剂①尿素，②1０％氢氧化钠溶液，③１％硫酸铜溶液，④２%卵清蛋白溶液(改为蛋清溶液:水＝1：9）(3）操作取少量尿素结晶,放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化.熔化得尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨,形成双缩脲。冷后,加10%氢氧化钠溶液约1mL,振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液１滴,再振荡。观察出现得粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成得蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。(由于杂质以及氨气得干扰,导致颜色不都就是紫红色)向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液:水=1：９）约１mＬ与１0%氢氧化钠溶液约２mＬ,摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴,随加随摇.观察紫玫瑰色得出现。2、茚三酮反应（1)原理蛋白质、多肽与各种氨基酸以及所有—氨基酸均能发生该反应，除无α-氨基得脯氨酸与羟脯氨酸呈黄色反应外,其它均生成蓝紫色化合物,最终生成蓝色化合物.氨、β—丙氨酸与许多一级氨化合物都有此反应.尿素、马尿酸、二酮吡嗪与肽键上得亚氨基不呈现此反应。因此,虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应得不一定都就是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步，第一步就是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸,酮酸脱羧成醛,放出CO2、ＮＨ3,水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步就是所形成得还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子与氨缩合生成有蓝色物质。反应机理如下:蓝紫色该反应非常灵敏，1:150万浓度得氨基酸水溶液即能给出反应,就是一种常用得氨基酸定量测定方法。但在定性、定量测定中,一方面要严防干扰物存在,另一方面要在适宜得PH条件下进行测定.该反应得适宜得ＰH为5~7，同一浓度得蛋白质或氨基酸在不同pＨ条件下得颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。(２)试剂①蛋白质溶液：2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水＝1:9）,②０、5%甘氨酸，③０、1%茚三酮水溶液，④０、1%茚三酮-乙醇溶液.（3）操作①取两支试管分别加入蛋白质溶液与甘氨酸溶液1mL,再各加0、5mＬ０、１%茚三酮水溶液,混匀,在沸水浴中加热１～2分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝色（pH不同颜色深浅不同）。②在一小块滤纸上滴一滴０、５％甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴一滴０、1%茚三酮－乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点得出现。3、黄色反应(１)原理含有苯环得氨基酸，如酪氨酸、色氨酸,遇硝酸后，可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色得硝醌酸钠。反应式如下多数蛋白质分子含有带苯环得氨基酸,所以呈黄色反应，苯丙氨酸不易硝化,须加入少量浓硫酸才有黄色反应.（2）试剂①鸡蛋清溶液(将新鲜鸡蛋清用6层纱布过滤，然后按鸡蛋清：水＝1:20配制而成.②大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。③头发。④指甲。⑤0、5%苯酚溶液。⑥浓硝酸。⑦0、３%色氨酸溶液．⑧０、3％酪氨酸溶液。⑨10%氢氧化钠溶液.(3)操作向７个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现得现象，有得试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入1０%氢氧化钠溶液至碱性,观察颜色变化(1~4管可能需要加热)。管号12３4５67材料鸡蛋清溶液大豆提取液指甲头发0、５%苯酚0、3%色氨酸0、3%酪氨酸浓硝酸4滴4滴少许少许4滴4滴4滴现象1现象２4、考马斯亮蓝反应(1)原理考马斯亮蓝G２50(R25０)具有红色与蓝色两种色调。在酸性溶液中,其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高,比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定．在０、01~1、０mg蛋白质范围内，蛋白质