土样中淀粉降解细菌的筛选——刘睿，吕卫娟，吴林榕，肖斌1、实验目的1.1掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。1.2掌握富集、平板稀释涂布法、平板划线培养法分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。1.3初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。2、实验原理在自然条件下，产淀粉酶的细菌和其它各种细菌混杂生活在土壤中，要想分离出来必须建立相应的“筛子”。淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。微生物酶产生菌的筛选具体分为增殖培养、初筛和复筛过程。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。复筛的目的是淘汰底产菌。3、材料与方法3.1材料3.1.1培养基配制的材料与试剂培养基配制的材料：营养琼脂（11.25g），淀粉（2.5g），废报纸，棉花，纱布，棉绳试剂：无菌水3.1.2玻璃器皿玻璃器皿：大三角瓶（500ml）1个，小三角瓶（250ml）2个，移液管1ml两支，10ml一支，试管十支，圆底培养皿十个，玻璃珠（20颗），酒精灯，大烧杯3.2方法3.2.1培养基制备3.2.1.1液体培养基：称取蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、可溶性淀粉0.2g溶于装有100mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个小三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。3.2.1.2固体淀粉培养基：用台秤分别称取11.25g营养琼脂和2.5g淀粉，再依次倒入大三角瓶中，瓶中加适量自来水，在电炉上加热（注：小心加热，以免烧糊），待瓶中颗粒完全融化后停止加热，定容至250ml，然后用制作好的棉塞赛住瓶口，再用棉绳包扎好，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。3.2.2培养方法3.2.2.1增殖培养称取土样10g，倒入盛有40mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30min制成土壤悬液,用无菌移液管分别吸取10mL土壤悬液加入液体培养基中,置于37℃的恒温培养箱中培养24h。3.2.2.2初筛取10支试管，用无菌移液管吸取1mL增殖培养后的菌悬液1mL放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀后即为10－1，再用无菌移液管吸取10－1的菌悬液1mL放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀即为l0－2稀释液，照此分别制成l0－3～l0－5的稀释液。将10-1～10-5土壤稀释液1mL涂布于平板培养基表面,每一稀释度涂布接种两块平板。用对应的移液管按浓度顺序依低到高分别往培养皿中各加1ml菌液，每一稀释度接种两块平板，并标注对应的标签为10-1～10-5，在无菌条件下往各个培养皿中加入加热后适当温度的的培养液，待培养液凝固后把培养基倒置过来，置于37℃的恒温培养箱中培养24h。待长出菌落后，滴加碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，进行划线培养。3.2.2.3复筛将10-2、10-3、l0－4、10-5初筛菌株稀释后在同一块平板上分别划线培养，于37℃恒温培养箱中培养20h，长出单菌落后滴加碘液,选择水解圈较大的菌株菌株即为所需菌株.4、菌种鉴定最后通过观察筛选到的菌株的菌落大小、形态，革兰氏染色和芽孢染色(方法详见微生物实验讲义实验四)等情况对筛选到的菌株进行初步鉴定。