三、含氮量的测定氮是发酵微生物所必须的氮源。原料中蛋白质含量的高低对发酵制品的质量关系很大。如啤酒酿造中，原料中蛋白质含量过高，往往能造成啤酒浑浊。但对酱油等发酵食品讲，则需选用蛋白质含量较高的原料。对酵母讲，含氮量则是酵母成品质量的一个重要指标。（一）原料中粗蛋白质的测定1、原理蛋白质测定常采用凯氏定氮法（Kjeldahl）。其原理是将试样与浓硫酸共热消化，使蛋白质分解，其中氮与硫酸化合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用标准酸接收，过量酸用标准碱滴定。凯氏定氮法所测得的为试样中总氮量，它除蛋白质中氮外，还包括氨基酸，酸胺、核酸等中的氮，换算成蛋白质，称为粗蛋白质。浓硫酸的作用：1)脱水使有机物炭化。2)氧化：浓硫酸在338℃以上分解产生氧气，能使有机物破坏，生成二氧化碳和水.硫酸铜的作用（催化剂）：2CuSO4→Cu2SO4+SO2+O2C+O2→CO2↑2H2+O2→2H2O↑Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+SO2+2H2O硫酸钾的作用（提高沸点）：K2SO4+H2SO4→2KHSO4使沸点提高到400℃。过氧化氢的作用：H2O2+2H+→2H2OE0=1.77VO2+4H+→2H2OE0=1.229V过氧化氢能力比氧强，能加速有机物分解。30%氢氧化钠的作用：（NH4）2SO4+2NaOH→2NH4OH+Na2SO4蒸馏出的氨被硫酸吸收：2NH3+H2SO4→（NH4)2SO4过量的硫酸用氢氧化钠滴定：H2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O2、试剂①浓硫酸②硫酸钾③硫酸铜（CuSO4·5H2O）④过氧化氢（30%）⑤30%氢氧化钠溶液（试剂1-28）⑥0.1V硫酸溶液（试剂1-29）⑦0.1N氢氧化钠溶液（试剂1-30）⑧0.1%甲基红指示剂（试剂1-31）3．测定步骤1)试样消化：准确称取2克试样，置入250毫升凯氏定氮瓶中，加3克硫酸钾和1克硫酸铜，加20毫升浓硫酸，瓶口安放一只小三角漏斗，于电炉上加热消化，消化装置见图1-2。若消化液色泽较难褪去，则冷却后，加3～5毫升过氧化氢，继续加热，直至消化液清澈透明为止。冷却，转入100毫升容量瓶中（瓶中预先加入约20毫升水），用水充分洗涤凯氏定氮瓶，冷却至室温，再用水定容至刻度，摇匀。2)加碱蒸馏；吸取50毫升稀释消化液，置入500毫升平底烧瓶中，加约100毫升水和数粒沸石，加60毫升30％氢氧化钠溶液（或在烧瓶上安一分液漏斗加碱），立即盖严，蒸馏约45分钟（或蒸出原液体积约1/3）。接收瓶中预先准确加入25或50毫升0.1N硫酸溶液。蒸馏装置见图1-3。3）滴定：蒸馏完后，用水洗涤冷凝器，取出接收瓶，加4滴0.1％甲基红指示剂，用0.1N氢氧化钠溶液滴定至黄色。4.计算式中（NV）H2SO4——接收瓶中硫酸溶液的当量浓度与体积（毫升）（NV）NaOH——滴定时消耗氢氧化钠溶液的当量浓度与体积（毫升）0.01401——氮的毫克当量（克）100/50——稀释倍数W——试样重量（克）式中6.25——氮与蛋白质的换算系数5．讨论1)凯氏定氮法既适用于有机氮，又适用于无机氮，其测定范围较宽。常量法可测定约40毫克氮，而用水蒸汽蒸馏的半微量法可测定至数毫克氮，最低可检出0．05毫克氮。2)凯氏定氮法消化时，必须在通风柜中进行。开始消化时宜用文火加热，稳定后，才用强火加热，中途需摇动凯氏定氮瓶,使附在瓶壁上的黑点冲下。3)凯氏定氮法消化时催化剂也可采用汞；蒸馏时也有加数粒锌防暴沸；接收液也可采用2～4％硼酸溶液，用标准酸滴定，其指示剂为甲基红一溴甲酚绿混合指示剂（试剂1－32），终点变色敏锐，其反应式：2NH3＋4H3BO3=（NH4）2B4O7＋5H2O（NH4）2B4O7＋H2SO4＋5H2O＝（NH4）2SO4＋4H3BO34)氮与蛋白质的换算系数是由实验确定，不同原料，其蛋白质的换算系数稍有不同。蛋白质中含氮量一般在16％左右，故换算系数为：100/16=6.25半微量定氮法（水蒸汽蒸馏法）本法的原理和测定步骤基本上与常量的凯氏法相同，所不同的是样品需要量少（几毫克固体样或几毫升液体样），适于含氮量低的试样。另外，碱化后蒸馏采用水蒸汽蒸馏法。(装置)测定步骤：吸取5毫升试液于50毫升干燥的凯氏定氮瓶中，以文火浓缩成粘稠状(约1～2毫升)。加1.8克混合催化剂(试剂１－36)(切勿粘于壁上)，加5毫升浓硫酸，摇匀，瓶口加一小漏斗.。以文火加热，加热时尽量避免泡沫飞溅，待泡沫停止发生后，加强火使其沸腾,(硫酸在瓶中沸腾回流，其回流程度以高达瓶颈的1/3处为宜)，直至消化液清澈透明。将消化液移入100毫升容量瓶中，用水定容至刻度。吸取25毫升稀释消化液，置入蒸馏器内。用