第三章生物化学分析鉴定方法2－－蛋白质本章内容概要及要求：在蛋白质分离纯化过程中，需要对蛋白质的含量和纯度不断进行检测，通过优化纯化方法获得高含量、高纯度的蛋白质产品，为蛋白质的结构、功能分析及产品开发提供材料。为了鉴定某种微量蛋白质在样品中的存在，常采用蛋白质免疫印迹的方法，利用抗原抗体的特异性来鉴定。此外，还可测定蛋白质的氨基酸序列，对其生物学功能进行鉴定等。一、蛋白质理化性质测定蛋白质理化性质测定二、蛋白质鉴定蛋白质鉴定蛋白质鉴定（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）典型的印迹实验包括三个步骤具体解析：第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。蛋白质鉴定三、蛋白质组研究的相关技术（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：2-D电泳1.1975年，PatrickOˊFarrel发明了二维凝胶电泳。2.操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS-PAGE。3.2-D胶上蛋白质鉴定（1）早期Westernblot鉴定（2）Edman降解法鉴定（3）肽质量指纹（peptide-massfingerprinting）技术鉴定（4）蛋白质组信息学（三）蛋白质序列测定肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。（3）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解蛋白质测序发展简史1.英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。2.建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（20世纪50年代）。3.Edman降解（20世纪70年代出现）。仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。进入20世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。4.20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂——DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。5.对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。6.毛细管电泳技术（20世纪90年代发展起来的微量分析技术）的采用，是蛋白质N端微量顺序测定方法学一个引人注目的发展。其灵敏度比HPLC高两个数量级。可在10fmol的水平检测氨基酸。微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。7.蛋白质C端测序：C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。（1）最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。（2）直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基的C端顺序测定。8.质谱法用于蛋白质顺序测定：（1）必要性：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰问题，Edman降解不能解决N端封闭肽的测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。（2）20世纪80年代初出现快原子轰击质谱（FAB质谱）能准确确定的分子量达到数千。相继发展的串行质谱可以把FAB得到的分子离子进行再一次惰性原子轰击，使肽链在不同部位断裂从而得到一组片段的质谱信息，使多肽顺序测定