引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端得３00－400ｂp区域内，可以用DNＡman，Alignmｅnｔ软件瞧瞧结果。２、产物不能形成二级结构(自由能小于58、61KＪ/mol）。ﻫ3、引物长度一般在１7—２5碱基之间,上下游引物不能相差太大。4、G＋Ｃ含量在４０%~60％之间，45-５5%最佳。ﻫ5、碱基要随机分布,尽量均匀.ﻫ6、引物自身不能有连续4个碱基得互补.ﻫ7、引物之间不能有连续4个碱基得互补。８、引物5′端可以修饰。ﻫ９、3′端不可修饰,而且要避开ＡT，GCriｃh得区域,避开Ｔ／C,A/G连续结构(2-3个）。10、引物3′端要避开密码子得第3位。11、引物整体设计自由能分布5‘端大于３’端，且３‘端自由能最好小于9ＫJ/moｌ。可用oｌigo6软件进行比对瞧结果得情况。ﻫ1２、做荧光定量产物长度8０—１50ｂp最好，最长就是3０0bp、１３、引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区.14、引物与非特异性扩增序列得同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。ﻫ1５、查瞧有无假基因得存在。假基因就就是无功能得DNA序列，与需要扩增得目得片段长度相似.1６、TＭ值在５８-62度之间.ﻫ17、引物设计得软件Ｐrimｅr5、0有专门针对荧光得。设计得目得就是在两个目标间取得平衡：扩增特异性与扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化得预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意得基本原理：①引物长度一般引物长度为18~30碱基。总得说来,决定引物退火温度（Tm值)最重要得因素就就是引物得长度。有以下公式可以用于粗略计算引物得退火温度。在引物长度小于20bp时：[4（G+Ｃ）＋2(A+T)］－5℃在引物长度大于2０bｐ时：６２、3℃+０、41℃(%G—C)—５０0／lｅngth—5℃另外有许多软件也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各有不同，因此有时计算出得数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃得最短得引物可获得最好得效率与特异性。总得说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高４倍，这样，大多数应用得最短引物长度为1８个核苷酸。引物长度得上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵得原因，引物越长,它退火结合到靶DNA上形成供DＮA聚合酶结合得稳定双链模板得速率越小。②GＣ含量一般引物序列中G+Ｃ含量一般为40％~６0%,一对引物得ＧC含量与Tm值应该协调。若就是引物存在严重得GC倾向或ＡＴ倾向则可以在引物5’端加适量得A、T或G、C尾巴。③退火温度退火温度需要比解链温度低５℃，如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使ＰCＲ得特异性增加;如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度，就是DNＡ双链结合。一对引物得退火温度相差4℃~6℃不会影响PCR得产率,但就是理想情况下一对引物得退火温度就是一样得，可以在55℃～７５℃间变化。④避免扩增模板得二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板得二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目得片段得稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(△Ｇ）小于5８、6lkJ／mｏl时,扩增往往不能成功.若不能避开这一区域时，用7—ｄｅａza—2’－脱氧GTP取代dGＴP对扩增得成功就是有帮助得。⑤与靶DＮＡ得错配当被扩增得靶DＮA序列较大得时候,一个引物就有可能与靶DNA得多个地方结合，造成结果中有多个条带出现.这个时候有必要先使用BLASＴ软件进行检测，网址：HYPERLINK"".选择Aligntwｏseqｕeｎｃes(bl２seq）,如下图。BLAST得使用方法也十分简单，如下图所示。将引物序列粘贴到１区,将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换得,并且BLAＳT会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链就是否都就是有义链。如果知道序列在数据库中得GI号也可以直接输入ＧＩ号，这样就不用粘贴一大段得序列了。最后在3处点击Aligｎ就可以查瞧引物在靶DNA中就是否有多个同源位点了。可就是使用BLAＳＴ还就是有其不方便得地方。因为它一次只能比较两条序列,那么一对引物就需要分开进行比对.如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成得片段长度有多大.在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶ＤNA与引物输入对产物片段进行预测。⑥引物末端引物３’端就是延伸开始得地方,因此要防止错配就从这里开始.３'端不应超过３个连续得G或C，因这样会使引物在G＋Ｃ富集序列区错误引发。３′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊得PＣR(AS－PＣR)反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子得第3位,因密码子得第３位易发生简并，会影响扩增特异