Ambion是如何设计定制合成以及验证siRNA特点Ambion独立的SilencerValidatedsiRNAs－－预证siRNAs，已经实验验证能有效沉默目标基因70%或以上，大小为21bp；3'末端以UU结尾，涵盖人类400多个基因有5nmol和20nmol两种冻干粉包装提供。要特别说明的是，由于Ambion的siRNA3’末端突出都是UU结尾的，完全模拟自然存在的siRNA，由于在化学合成的过程中，添加U的试剂成本要比T贵得多，难度大，UU末端合成成本要远远高于TT末端或者其他末端，因此你会发现，Ambion的商品siRNA要比其他品牌贵不少，有如川菜一般劲辣。同样的，在设计siRNA时，Ambion的所有产品设计原则也是优先寻找mRNA序列中带有AA的下游19个碱基（得到3’UU末端），也就是务求令siRNA的21个碱基完全匹配mRNA序列。尽管Tuschl本人后来也表示siRNA3’末端的UU作用并不很大，多数公司设计是直接找19nt序列后直接加TT，这样设计难度也小很多，但是Ambion公司却一直坚守UU法则，不曾放弃。SilencerValidatedsiRNAs现在的序列信息也免费开放提供，包括厂家验证的数据都一起提供。由于Ambion公司提供的预证siRNA工作浓度为30nM，比多数厂家100nM的有效工作浓度要低很多，就算同样包装大小的siRNA比别人贵3倍，每次实验成本也还是Ambion的划算点。知识产权，或者说服务创造价值，大概就体现在这里吧。由于Ambion给ABI收购了，所以买Ambion的siRNA还可以直接购买ABI公司提供的相应基因的Taqman荧光定量RT-PCR试剂盒，非常方便，用不着打着灯笼到处搜罗不同品牌的试剂，为联合国大军之间的配合作战而烦恼了。正好ABI公司大量人类基因的荧光定量RT-PCR检测试剂盒也非常出名，这样就可谓一步到位，只可惜价格很高贵。SilencerPre-designedsiRNAs－－预设计siRNAs,是Ambion公司联手CenixBioScience公司以业内非常成熟的siRNA设计软件来设计。除了已知的公开法则，包括我们前面提及的坚持优先序列中的AA下游19个碱基，务求21个碱基完全和mRNA匹配，3’端UU突出结尾等完全模拟自然Dicer酶切结果，还包括了多年的实验心得，比如siRNA反义链的3'端GC含量高，5'端GC含量低有助于提高siRNA效率；此外该软件并非只顾埋头设计，还会对已知序列进行检索以避免和其他基因同源而导致脱靶反应，还要检索已知的SNP库以避开SNP位点，已知的蛋白质结合位点如CpG位点也要避开（蛋白质结合位点会影响RICS复合物与mRNA的结合）等等工作；以沉默效率70%以上作为评估成功标准对其设计进行验证测试：针对400多个人类内源转录本（包括难设计的基因）而设计的1100多个siRNAs成功率高达82％以上－－因此，Ambion保证3个以上针对同一目标基因而设计的siRNA中至少有2个能使目标基因的沉默效率达到70％或以上，同一基因你订购3个Pre-designed的siRNAs就可以了，3个里正好有2个有效siRNAs可以作为平行对照。厂家提供NCBI的RefSeqwww.cellservice.cn上列出的人类、小鼠和大鼠的全部基因的siRNAs，品种很齐全，是由化学合成的、已经纯化和退火的即用型siRNA，当然，序列信息是提供给你的。5nmol标准纯化的价格在2600-3200之间。