酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性常见电泳技术电泳设备水平电泳系统聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；对pH和温度变化较稳定；几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。SDS－PAGE的原理不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的蛋白质混合物分离能力的关系肿瘤细胞的侵袭移动细胞间基质结构示意图肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogenactivator,PA)和金属蛋白酶(metalproteinase,MMP)类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨基酸序列的同源性分为三大类：（1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间质胶原,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原,但不能降解明胶和Ⅳ型胶原；（2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原；（3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原酶以及Ⅰ型胶原的氨基端。通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。MMP-2又叫明胶酶A，其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量为72kDa。MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在细胞内存在形式时发现的，它能够与MMP-9聚合形成异源二聚体，保护和调节MMP-9活性，从而促进恶变细胞的浸润和转移。检测MMP-9和MMP-2的活性，对分析肿瘤细胞恶性程度和预后提供帮助。由N端的310螺旋、C端的α螺旋和中间的和中间的八段反平行的β折叠所构成，这八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构。此β折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N端310螺旋所封闭。在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。MMP-2的结构MMP-9的结构NGAL能与MMP-9以二硫键的方式结合，能起到保护和调节MMP-9功能的作用，所以NGAL与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有pcDNA3空白质粒载体的SHEEC细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有pcDNA-NGAL(-)的SHEEC细胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性均明显降低；而与此同时，转染有pcDNA-NGAL(＋)的SHEEC细胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使NGAL基因表达发生改变可以对SHEEC细胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性产生明显影响。MMP-2和MMP-9活性的强弱与肿瘤浸润和转移的能力密切相关。明胶是这两种酶的底物。所以在体外通过酶谱法（Zymography）检测样品（组织，细胞培养液，血清，血浆，尿）中MMP-2和MMP-9的活性，对了解肿瘤细胞的恶性程度、监测治疗效果和评价预