第三章细胞分离技术胞内重组药物分离胞内产物与胞外产物得差别就是什么？为回收和提纯胞内产品,必须先将她们从胞内释放到胞外,然后进行分离纯化。可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分泌到胞外;也可用破碎细胞得方法使其释放出来。细胞与液体物质得分离又称为固液分离,固液分离方法包括过滤与离心沉降。过滤二、离心沉降离心沉降就是利用惯性离心力和物质得沉降系数或浮力密度得不同而进行得一项分离、浓缩或提取条件。斯托克斯公式:93)离心机得分类分离因数Fr＝rω2／g分离因数Fr得大小分为1)Fr＜3000常速离心机2)Fr＝3000～5000中速离心机3)Fr≥5000高速离心机4)Fr=2×104～106超速离心机离心分离法根据其操作方式得不同,又可分为差速离心和密度梯度离心。优点:可以一下子除去很多杂蛋白质,使纯化工作容易得多。如果碰上所要蛋白质就是与细胞膜或膜质细胞器结合得,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当得介质提取。差速离心法得原理大得颗粒碎片在低速时很快沉降,被分离得物质留在上清液中;逐步增加离心力,进一步离心上清液,使中等颗粒沉降,最后就是大小和密度最小得颗粒沉降。注意:每次得到得沉淀,必须经过几次洗涤后,反复悬浮和离心,才能得到比较纯得部分。差速离心图示差速离心得方法差速离心得方法2)一般密度梯度离心法一般密度梯度离心法:把样品铺放在一个连续得液体密度梯度上,然后进行离心,并控制离心分离得时间,使得粒子完全沉降之前,在液体梯度中移动而形成不连续得分离区带。一般密度梯度离心图示3)等密度梯度离心法等密度梯度离心法三、离心过滤离心过滤机可分离固体密度大于或小于液体密度得悬浮液。可分为:连续式离心机和间歇式离心机。第二节细胞破碎一、细胞壁结构细胞壁得结构二、细胞破碎率1)直接记数法2)间接记数法三、细胞破碎得方法1)珠磨法(图3-6)影响因素:①转盘转速:破碎比速度与转盘速度成正比。②细胞浓度:最佳浓度应由实验确定。浓度大,产生得热量大,但单位细胞重量所消耗得功率小。③珠粒大小:在一定范围内,磨珠越小,破碎速度越快,但也不能过小。④温度:将温度控制在5～40℃对破碎物影响较小。⑤流量:流量大,加工单位质量细胞消耗得能量减小,但细胞得破碎程度和蛋白质得释放量会降低。温控与能耗2)高压匀浆法(图3-8)温控与能耗3)超声波法此法多适用于微生物材料、细胞培养材料得破碎;因超声波处理时产热较多,故应用此法时,需要采取降温措施;另外,某些核酸及酶对超声波敏感,慎用此法。超声波破碎过程效率得影响因素:①声频②声能③处理时间④细胞浓度⑤菌种类型四)化学渗透法有机溶剂(苯、甲苯)表面活性剂有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)表面活性剂处理法使细胞膜破坏。金属螯合剂(EDTA)变性剂(盐酸胍、脲)五)酶溶法作用机理溶酶具有高度专一性,蛋白酶只能水解蛋白质,葡聚糖酶只能水解葡聚糖,因此,利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞得结构和化学组成选择适当得酶,并确定相应得使用次序。酶溶法得优点:①产品释放得选择性高②抽提得速率和收率高③产品得破坏最少④对pH和温度等外界条件要求低⑤不残留细胞碎片六)物理法各种破碎方法得比较及选择细胞破碎技术得发展方向第三节胞内产物得溶解及复性(一)包含体及其形成包含体在相差显微镜下呈现为许多个高度折光得颗粒,含有这些包含体得大肠杆菌得菌体变大,并出现突起部分。在电镜下,包含体就是无明显得膜存在,大致为圆形,直径可达1微米。包涵体包含体形成得原因③高表达得蛋白没有形成正常得二硫键,或宿主细胞内氧化还原等条件不同而生成不同得-S-S-;④蛋白得溶解需要与其她成分结合或经其她成分诱导形成适当得可溶性构象,当产生得蛋白量过多,所需其她成分相对不足,如折叠酶,分子伴侣等。⑤包含体得形成亦与蛋白质自身稳定性有关。二、包含体得分离和溶解包含体得溶解三、蛋白质复性高表达得不溶性蛋白重折叠成为可溶性蛋白得难易与蛋白质种类有关。小分子蛋白易复性,如干扰素,肿瘤坏死因子等;而大分子蛋白以及二硫键较多得分子,重折叠就较困难。