T细胞分离激活扩增T细胞的分离1、抽20ml血到抗凝管内，或每1ml全血加入0.1ml（125-250）/ml肝素液摇匀，汇总到50ml离心管，加入20mlPBS(与全血等量)稀释。2、提前在15ml离心管内加入3ml淋巴分离液。3、用刻度吸管沿倾斜管壁，把稀释液缓慢叠加与分层液面，注意保持界面清楚。3ml全血+3mlPBS（已混匀）+3ml淋巴细胞分离液。4、离心2000r，20min。5、离心后取出离心管，可见管内液体有分层，抽取单个核细胞层至50ml离心管，加入5倍体积的PBS混匀。6、2000r，10min离心。用PBS重悬，计数T细胞。1500r，10min，离心。用含血清的1640培养基重悬细胞为1×107/ml。CD3+T的筛选A、磁珠的洗涤。a、将小管内的免疫磁珠摇匀悬浮（漩涡〉30s，或倾斜旋转5min）。b、取出所需量的免疫磁珠到1.5ml试管内，单个核细胞总数为1×107/ml，每毫升中适宜磁珠数量为2.5×107个。c、加入1ml含血清的1640并混悬好，漩涡〉30s，或保持滚动至少5min。d、将试管放入磁体架内1min，吸管吸弃上清。f、试管离开磁体，用与初始免疫磁珠体积等量体积的培养液重悬磁珠。B、分离a、将混悬好的免疫磁珠试管放在磁性细胞分离架上，吸取上清，加入单个核细胞悬液，拿起试管，离开磁场，轻轻混悬几秒钟。b、将免疫磁珠和样本放在4°C冰箱孵育20min，倾斜旋转。c、将试管放在细胞分离架上分离2min，d、待磁珠结合细胞到达试管壁后用吸管轻轻吸取上清。f、试管离开磁体，加入1ml含血清的1640，轻轻混合，洗涤，尽量使磁珠脱离细胞的丢失减少到最低。g、将试管放在磁体上2min，用吸管吸弃上清。h、重复f-g清洗2次。i、洗完后，加含血清的1640到筛选的CD3阳性细胞中，混悬。计数。CD3阳性细胞的激活和扩增A、CD3/CD28beads的洗涤步骤同二AB、T细胞的激活a、6孔板5×105/ml，2ml培养液。b、加入已洗好的beads，使beads：细胞=1:1.c、放入培养箱培养3天。C、扩增a、3天内培养液不需要更换，第3天时加30U/mlIL-2，同时换培养基，细胞在48h后数量会增殖到2倍，但不允许超过2×106/ml。b、放入培养箱培养。c、每天观察细胞，记录细胞的大小和形状，在细胞液变黄时可看到细胞萎缩和细胞增殖率。d、细胞隔一天计数。e、4-5天刺激后可移去beads，上下移动细胞5-10次，避免有气泡和湍流，这个可以使细胞和beads分离。收集细胞到1.5ml管内，放到磁体上1min至beads到管壁上。把细胞移到另外的管内。分离beads前后各计数一次。