技术咨询电话：400-607-9999注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途两管式RT-PCR试剂盒(Two-TubeRT-PCRKit)货号：M020022产品及特点:本试剂盒是整合cDNA第一链合成试剂盒和即用型PCR试剂盒而得的RT-PCR试剂盒。cDNA第一链合成反第一链合成反应分别在两个离心管中进行。本试剂盒具有下列特点：cDNA第一链合成试剂盒具有灵敏性高、使用范围广、使用RandomPrimerOligodTPrimer和基因专一引物等优点。PCR试剂盒具有即用简单等优点，PCR产物可以直接上样电泳。两管式操作，RT和PCR在不同试管中进行，本试剂盒可以进行10次逆转录反应，100次PCR反应，便于单独优化反应条件。收率高，最长可扩增5Kbp以上的RNA。规格及成分成分10次包装MMLV逆转录酶(200U/ul)10ulRnaseInhibitor(40U/ul)10ul5×RTBuffer50uldNTP(10mMeach)30ulOligo(dT)18引物（0.5ug/ul）10ul随机引物（0.2ug/ul）10ulRNase-free水1.0mlPCRMagicMix2.0-A100次使用手册一份运输及保存：干冰运输，-20℃保存，有效期一年。使用方法一：合成PCR用的1st-strandcDNA按下表配制RT反应体系:RNA模板总RNA100-500ng或poly(A)mRNA10-500ng或专一的RNA0.01pg-500ng注意：RNA样品不能含有基因组DNA污染。引物Oligo(dT)18(0.5ug/uL)1uL或随机引物(0.2ug/uL)1uL或RNA模板专一性引物15-20pmol注意：随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。RNase-free水补水到12uL70℃保温5分钟后立即冰浴。严格按下表顺序加入各成分：5XRTBuffer4uLRNaseInhibitor(40U/uL)1uLdNTP(10mMeach)2uL37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GCRNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃5分钟。加入1uL(=200U)的MMLV逆转录酶，反应终体积为20uL。42℃保温60分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟）。此步为RT反应。70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。二：合成建文库用的1st-strandcDNA按下表配制RT反应体系:RNA模板poly(A)mRNA1ug或专一的RNA0.5-1ug注意：RNA样品不能含有基因组DNA污染。引物Oligo(dT)18(0.5ug/uL)1uL或随机引物(0.2ug/uL)1uL或RNA模板专一性引物100pmol注意：随机引物于RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。RNase-free水补水到12uL70℃保温5分钟后立即冰浴。严格按下表顺序加入各成分：5XRTBuffer4uLRNaseInhibitor(40U/uL)1uLdNTP(10mMeach)2uL37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GCRNA模板，可以改成45℃保温5分钟。如果使用随机引物，则改成25℃5分钟）。加入1uL(=200U)MMLV逆转录酶，反应终体积为20uL。42℃保温60分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟）。此步为RT反应。70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以用于第二链cDNA的合成或放置在-20℃长期保存。三：用对照模板合成cDNA(需要用同位素，需要对照的客户需要单独跟本公司联系)按下表配制RT反应体系:对照RNA模板(0.5ug/uL)2uL引物Oligo(dT)18(0.5ug/uL)1uL或随机引物(0.2ug/uL)1uL或对照专用引物2uLRNase-free水补水到11uL70℃保温5分钟后立即冰浴。严格按下表顺序加入各成分：5XRTBuffer4uLRNaseInhibitor(20U/uL)1uLdNTP(10mMeach)2uL37℃保温5分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是25℃。加入1uL(=200U)MMLV逆转录酶，反应终体积为20uL。42℃保温60分钟（但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，然后再转移到42℃保温60分钟）。加1uL0.5MEDTA，放置在冰上待用。电泳检测。合成的cDNA的量一般有加入RNA总量的50%以上，电泳一般能出现1.1Kb的片段（如果使用随机