会计学第一节遗传工程概述遗传工程广义：细胞工程、染色体工程细胞器工程、基因工程酶工程、发酵工程狭义：基因工程基因工程概述基因工程是20世纪(shìjì)70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。→1982年经美国食品及药物管理局批准，采用基因工程方法在细菌中表达(biǎodá)生产的人的胰岛素进入市场，成为基因工程产品直接造福于人类的首例→1985年转基因植物获得成功→1996年克隆羊诞生。→现在，人类已利用这一技术改造和创建新的生命形态、生产药品、疫苗、牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。基因(jīyīn)工程的基本步骤：1.目的基因(jīyīn)的分离或合成2.将目的基因(jīyīn)与载体DNA连接，构建重组DNA分子-表达载体3.将重组DNA分子导入受体细胞，并获得具有外源基因(jīyīn)的个体4.转基因(jīyīn)生物的检测与鉴定5.转基因(jīyīn)生物的安全性评价第二节基因的分离基因分离（克隆(kèlónꞬ)）包括3个步骤：1.目标DNA片段（基因）的分离2.目标基因克隆(kèlónꞬ)到载体上3.载体导入宿主细胞并在其中大量复制一、工具酶1、限制性内切核酸酶限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列的磷酸二脂酶Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化(cuīhuà)限制性切割和修饰核苷酸2种功能Ⅱ型酶：遗传工程中应用最广泛Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位点是非对称的Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特异识别和切割的序列部位②DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的③断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端）④内切酶的切割和修饰(xiūshì)功能由两个不同的酶催化所完成，即内切酶活性和甲基化作用活性是分开的限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物(chǎnwù)连接图12-1通过用相同(xiānꞬtónꞬ)的限制性内切酶切割形成一个重组DNA分子限制性内切酶SmaI的识别(shíbié)及酶切位点2、DNA连接酶DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具(gōngjù)酶，能催化DNA中相邻的3’–OH和5’–磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来3、反转录酶反转录酶是一类以RNA为模板(múbǎn)来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNAlibrary）4、聚合酶链式反应(PCR)PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明,1993年诺贝尔化学奖PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种(sìzhǒnɡ)主要成分：两个引物（一般为20bp）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）和四种(sìzhǒnɡ)脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤(bùzhòu)：1）变性：95℃，DNA双链分离成单链2）退火(复性)：55℃左右，引物与单链的模板DNA序列互补结合3）延伸：72℃左右，Taq酶通过在引物的3’-OH端增加碱基的办法使引物延伸表12-2PCR循环(xúnhuán)数与PCR产物的拷贝数之间的关系二、载体1、重组DNA技术重组DNA：指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子重组DNA技术是基因克隆的关键技术，其主要步骤为：1)从细胞或组织获得DNA并纯化2)用限制酶切割DNA3)将获得的限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子4)重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子--克隆5)克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化6)克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究(yánjiū)或商业开发。图12-5重组(zhònꞬzǔ)DNA技术流程2、载体载体：将外源基因送入受体细胞的工具载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等载体特点：①在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子，有独立的复制起始位点②有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增③有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主(jìzhǔ)细胞④分子量小，多拷贝，易于操作⑤具有安全性等（1）细菌(xìjūn)质粒：广泛应用于