膜片钳技术与应用重庆医科大学儿童医院儿研所陈恒胜第一部分：膜片钳基础及原理第二部分：膜片钳实验系统组成第三部分：膜片钳实验基础第四部分：膜片钳的应用细胞膜的结构和离子通道：细胞膜由脂质双分子层和蛋白质组成，蛋白质又包括整合蛋白和表面蛋白。离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细胞内外的一些无机离子如Na,kCa等带电离子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不同分布态势，这种态势和在不同状态下的动态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础。这些无机离子通过离子通道的进出所产生的电活动是生命活动的基础，只有在此基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。因此，了解离子通道的结构、功能以及结构与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.离子通道结构研究：目前，绝大多数离子通道的一级结构得到了阐明，但最根本的还是要搞清楚各种离子通道的三维结构，在这方面，美国的二位科学家彼得·阿格雷和罗德里克·麦金农做出了一些开创性的工作，他们利用X光绕射方法得到了K离子通道的三维结构，二位因此获得2003年诺贝尔化学奖。有关离子通道结构不是本PPT的重点，可参考杨宝峰的≪离子通道药理学≫和Hill的≪IonicChannelsOfExcitableMembranes≫..离子通道功能观察的两种技术对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术电压钳(Voltageclamp)技术膜片钳(patchclamp)技术cole电压钳的原理：用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位。从而实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导致Vm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化，致使Vm≠Vc,Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。膜片钳（PatchClamp)：在利用电压钳观测了动作电位期间膜电导的变化之后，人们一直想搞清楚膜电导变化的机制，当时的实验证明，离子的跨膜流动的速度很快，膜电导又具有离子选择性，并可被某些药物特异性地阻断，这些现象提示离子可能是通过一些专一性的“孔道”样结构通过细胞膜的，于是提出了“离子通道”的假设。为了证实离子通道的存在，也为了克服电压钳的缺点，ErwinNeher和BertSakmann在电压钳的基础上发明了膜片钳（patchclamp）。并利用该技术首次在蛙肌膜上记录到PA级(10-12A)的乙酰胆碱激动的单通道电流,首次证明了离子通道的存在.并证明在完整细胞膜上记录到的膜电流是许多单通道电流总和的结果。这一技术的问世，给细胞生物学的研究带来了一场革命，被誉为与分子克隆技术并驾齐驱的划时代的伟大发明。二人因此而获得诺贝尔生理或医学奖。膜片钳是从PatchClamp的翻译，Patch是小片，小块的意思，这里指膜片，这个膜片可大可小，大到整个细胞膜，小到细胞膜上的一平方微米，Clamp是钳，夹的意思，这里指固定，钳制的意思，指通过将patch上的膜电位人为地控制在某一水平，或从一个水平瞬间跃迁到另一水平，从而记录patch上的单个离子通道或整个细胞膜上某一种类的离子通道的电流，从而通过记录离子通道电流来反映离子通道的功能膜片钳（PatchClamp)的基本原理：利用尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端和细胞膜形成紧密封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（patch）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定膜电位(clamp)，然后对电极尖端下面积仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。从而将电生理学技术提高到记录和研究单个蛋白质的分子水平膜片钳与电压钳的区别根据实验要求，可组建不同的实验系统。但也有一些共同的基本组成部件，其中包括电子学部件:放大器；计算机接口，数据采集、分析系统。光学部件和光电接口：显微镜；监视器等