EMSA操作流程寡核苷酸标记：将序列互补的寡核苷酸片断在TEN-buffer（10mMTris,1mMEDTA,0.1MNacl,pH8.0）中按摩尔比1：1混合。95℃10min使核苷酸片断充分解离。将样品缓慢冷却至15-25℃。用灭过菌的TEN-buffer将核酸稀释至3-4pmol/ul取3.85pmol或100ng稀释好的核苷酸加入小炮弹管中，并加入ddH2O使终体积达到10ul。（对照管中加入1ul对照寡核苷酸（管6）和9ul的ddH2O）。将以上小管放在冰上并依次加入以下试剂：4ul5×Labelingbuffer（管1）4ulCoCl2-solution（管2）1ulDIG-ddUTPsolution（管3）1ul末端转移酶（400U）（管4）小心的将以上溶液混匀并迅速进行离心。在37℃反应15min，之后置于冰上。加入2ul0.2MEDTA(pH8.0)终止反应。再加入3ulddH2O，使终体积达到25ul，标记好的寡核苷酸浓度达到4ng/ul或0.155pmol/ul。标记效率测定：试剂准备：见样品检测部分的试剂准备。按下表制备系列稀释的制备标记寡核苷酸和对照组标记寡核苷酸。管号寡核苷酸（ul）稀释母液管TEN-buffer稀释倍数终浓度（fmol/ul）终浓度（ng/ul）1最初管0-1554221181：1015.50.4322181：1001.550.04423181：10000.1550.0045--20-00各取对照组和制备组1-5号管中标记的寡核苷酸1ul点在尼龙膜上紫外灯下交联5min或120℃烤30min使标记的寡核苷酸固定在膜上。15-25℃在Washingbuffer中漂洗膜2min。在10mlBlockingsolution中孵育30min。在20mlAnitybodysolution中孵育30min。用10mlWashingbuffer漂洗两次，每次15min。在10mlDetectionbuffer中平衡2-5min。将膜转有DNA的一面向上平放于塑料膜上，在上面均匀加上0.1mlCSPDworkingsolution。立即将塑料膜折起，盖在尼龙膜上，避免气泡产生，使CSPD能均匀分布于膜表面，15-25℃孵育5min。挤出多余的液体，将塑料膜沿尼龙膜边封好，在37℃再孵育10min。15-25℃用X胶片曝光15-25min。通过与对照组DIG-标记的DNA（管7）曝光情况对比就可以确定标记的效率。样品检测：配制浓度为6－8％含0.5×TBE的非变性聚丙烯酰胺凝胶。（配方：3.6mlH2O;1.2ml丙稀酰胺；600ul甘油；600ulTBE；AP42ul；TEMED2.1ul）将用DIG标记的寡核苷酸链用水稀释到15－30fmol/ul.将标记的对照组寡核苷酸链用水稀释到15.5fmol/ul.样品准备：编号样品（实验组/对照组）1标记的寡核苷酸2标记的寡核苷酸和相应蛋白3标记的寡核苷酸和相应蛋白及用于特异竞争的未标记寡核苷酸。（125倍于标记寡核苷酸）配制反应体系：123BindingBuffer(5号试剂瓶)4ul4ul4ulpoly[d(L-C)]（9号瓶）1ul1ul1ulpolyL-Lysine(11号瓶)1ul1ul1ulDIG-标记的寡核苷酸（7号瓶）[0.4ng/ul]2ul2ul2ulddH2O12ul11ul10ul未标记核苷酸（6号瓶）[0.1ug/ul]－－1ulOct2Afactor(8号瓶)[25-75ng/ul]－1ul1ul将配好的反应体系混合均匀，在15－25℃温育15min。将反应体系转移至冰上并在每管中加入5ul无溴酚蓝的Loadingbuffer（12号瓶）并迅速上样电泳。[电泳缓冲液：0.5×TBE(Tris-borate-EDTAbuffer,10×：890mMTris，890mMboricacid,20mMEDTA,pH8.0)]注意：电泳时不能使胶过热，应在4℃中进行。电泳恒压40V，5h(根据DNA片断大小进行调整)。小心的分开两块胶板，将一块同胶等大的尼龙膜在转膜buffer（0.5×TBE）中平衡5min后贴在膜上，赶尽胶与膜之间的气泡。将4层与胶等大的滤纸在转膜buffer中平衡后铺于尼龙膜上，用玻璃棒赶出滤纸和膜之间的气泡。将剩下的一块玻璃板和胶分离，再在胶暴露的一面贴上4层平衡好的滤纸。置整个体系于转膜设备中，在恒压30V的条件下转膜60min。转膜结束后，将膜取出，在80℃烘烤5min。把膜贴在一层用2×SSC（0.03M柠檬酸钠,0.3MNac1）浸透的滤纸上（转有DNA的一面向上），在紫外灯下交联5min。试剂准