《分子生物学实验》实验报告实验名称:蛋白印迹技术姓名:陈杰学号:3140104666序号:25同组同学:唐陈曦带教教师:刘伟俞萍实验日期:2015年9月29日目录TOC\o"13"\h\z\uHYPERLINK\l"_Toc431714216"1、原理PAGEREF_Toc431714216\h3HYPERLINK\l"_Toc431714217"1、1Westen印迹技术PAGEREF_Toc431714217\h3HYPERLINK\l"_Toc431714218"1、2RTPCRPAGEREF_Toc431714218\h4HYPERLINK\l"_Toc431714219"1、3聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(2DPAGE)PAGEREF_Toc431714219\h5HYPERLINK\l"_Toc431714220"2、操作步骤PAGEREF_Toc431714220\h5HYPERLINK\l"_Toc431714221"2、1安装垂直板型电泳装置PAGEREF_Toc431714221\h5HYPERLINK\l"_Toc431714222"2、2凝胶得制备PAGEREF_Toc431714222\h5HYPERLINK\l"_Toc431714223"2、3转膜PAGEREF_Toc431714223\h6HYPERLINK\l"_Toc431714224"2、4封闭PAGEREF_Toc431714224\h6HYPERLINK\l"_Toc431714225"2、5一抗反应PAGEREF_Toc431714225\h6HYPERLINK\l"_Toc431714226"2、6洗涤PAGEREF_Toc431714226\h7HYPERLINK\l"_Toc431714227"2、7二抗反应PAGEREF_Toc431714227\h7HYPERLINK\l"_Toc431714228"2、8洗膜PAGEREF_Toc431714228\h7HYPERLINK\l"_Toc431714229"2、9检测PAGEREF_Toc431714229\h7HYPERLINK\l"_Toc431714230"3、实验结果PAGEREF_Toc431714230\h8HYPERLINK\l"_Toc431714231"3、1照片记录PAGEREF_Toc431714231\h8HYPERLINK\l"_Toc431714232"3、2数据处理PAGEREF_Toc431714232\h8HYPERLINK\l"_Toc431714233"4、讨论PAGEREF_Toc431714233\h101、原理1、1Westen印迹技术蛋白质印迹技术又称免疫印迹技术与Western印迹技术(Westernblotting),就是鉴别蛋白质得分子杂交技术。Westernblotting得原理就是将经过SDSPAGE分离得蛋白质样品转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。且能保持电泳分离得蛋白质得相对位置不变(转膜装置与预染得标准相对分子质量蛋白得转膜结果见图825～527)。以固相载体上得蛋白质或多肽作为抗原,与对应得未标记得一抗起免疫反应,再与酶或同位素标记得二抗反应,经过底物显色、化学发光或放射自显影,可以检测电泳分离得某种特定蛋白成分得存在与含量。该技术也广泛应用于检测某种蛋白得表达水平。Westernblotting实验过程主要有以下几个步骤:1、SDSPAGE分离待检测得蛋白质;2、转膜:将SDSPAGE分离得蛋白质转移到膜上;3、封闭:即利用非反应活性物质封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质得区域;4、抗体结合:即利用相应蛋白质得抗体(一抗)与待测蛋白质进行免疫结合,再与酶或同位素标记得第二抗体起反应;5、底物显色或放射自显影检测电泳分离得特异性目得蛋白得存在与否与含量。Westernblotting得转膜方式以电转移最为常用,固相载体主要有:硝酸纤维素薄膜、尼龙膜与聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。硝酸纤维素薄膜结合蛋白得能力为100ug／cm2,综合性能较好,以往使用得人较多;尼龙膜结合蛋白质得能力较强(480ug/cm2),有很高得灵敏度,但结合背景较高;PVDF膜具有较好得结合蛋白质得能力(200ug/cm2),且能较牢固地结合蛋白质,该膜