会计学实验五：大肠杆菌感受态的制备(zhìbèi)实验六：重组DNA的转化与抗药性筛选实验(shíyàn)五一、基因克隆(GENECLONE)2、基本步骤（4）转（转化至宿主细胞）：将重组体引入（转化或转染）到宿主细胞（受体细胞）中，转化后的细胞进行(jìnxíng)扩增繁殖，获得大量的细胞繁殖群体。（5）筛（筛选阳性细胞克隆）：从大量的细胞繁殖群体中筛选出转化成功（带有重组体）的阳性细胞克隆。（6）表（表达目的蛋白质）：重组体在宿主细胞中表达目的蛋白质。二、感受态细胞(xìbāo)的制备及重组体转化重组(zhònꞬzǔ)体转入受体菌转化(zhuǎnhuà)方法CaCl2处理感受态(competent)：宿主细胞(xìbāo)处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞(xìbāo)称为感受态细胞(xìbāo).正常细胞(xìbāo)都有细胞(xìbāo)膜（细菌还有细胞(xìbāo)壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞(xìbāo)通透性增大，处于感受态。制备感受态细胞和转化的常用方法CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5106~2107转化子/g质粒DNA,简单、快速(kuàisù)、重复性好、菌株适用范围广。电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显微注射法(microinjection)；磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0℃）0.05~0.1M的CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。同时在转化体系(tǐxì)中的DNA形成的抗DNase的羟基－钙磷酸复合物能粘附于细菌表面，经过42℃短时间热休克（heatshock）处理，促进感受态细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(selectiveculture)平板上即可筛选出所需的转化子。转化与感受态细胞转化(transform)：在分子克隆技术中，转化特指(tèzhǐ)质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。区别转化、转染(transfection)与转导(transduction)重组DNA分子导入受体细胞的手段将含有真核生物基因的质粒导入细菌内进行表达称为转化。转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。转导则是指病毒(bìngdú)从被感染的细胞(供体)释放出来，再次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。三、感受态细胞制备及重组(zhònꞬzǔ)体转化的实验操作及注意事项细菌(xìjūn)转移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm×5min取出EP管后，每管加入LB培养基800l，置于370C摇床（100~150r/min），温和震荡45min用无菌弯头玻璃铺菌器将200l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面室温放置10min，使液体被吸收(xīshōu)倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长重组(zhònꞬzǔ)DNA的转化与抗药性筛选重组(zhònꞬzǔ)体克隆的筛选与鉴定筛选的依据：基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。筛选的方法：抗药性标志的选择(xuǎnzé)插入表达筛选-半乳糖苷酶系统筛选（-互补）(-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深蓝沉淀）(插入失活法(huófǎ))抗药性标记选择菌落杂交筛选法内切酶图谱(túpǔ)鉴定PCR筛选重组子Southern印迹杂交和菌落原位杂交DNA序列分析免疫化学检测法原理：基因(jīyīn)载体上含有ß-半乳糖苷酶（LacZ)的基因(jīyīn)，当外源DNA插入到载体的LacZ基因(jīyīn)上后将造成ß-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG（异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。α互补(hùbǔ)的检测内容(nèiróng)总结