<包涵体得纯化与复性总结二、包涵体得洗涤1、包涵体得洗涤问题通常得洗涤方法一般就是洗不干净得,我以前就是这么做得,先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分,过滤除去未溶解得物质,注意留样跑电泳,然后用水稀释到4M,离心把沉淀与上清分别跑电泳,如此类推可以一直稀释到合适得浓度,您可以找到一个合适去除杂质得办法,其实这就就是梯度沉淀得方法,我觉得比通常得直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解,所以您要注意未溶解得部分,您可以跑电泳对比,因为有时候难溶解得就就是您得目标蛋白,所以每次处理都要把上清与沉淀跑电泳对比,免得把目标蛋白弄丢了。此外刚处理完得包涵体好溶解。冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量得溶剂。如果说就是不少不溶解得不就是您要得,那就不用管了。2、如何得到比较纯得包涵体对于包涵体得纯化,包涵体得前处理就是很重要得。包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ与其它杂质。洗涤常用1%以下得中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel与NP40等加EDTA与还原剂2-巯基苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50mMNaCL。这样提取得包涵体纯度至少可达50%以上,而且可保持元结构。也可用低浓度得盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附得大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜,使用得还原剂为0、1-5mM。EDTA为0、1-0、3mM。去垢剂如TritonX-100、脱氧胆酸盐与低浓度得变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白OmpT(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体得溶解与复性过程中可导致重组蛋白质得降解。对于尿素与盐酸胍得选择:尿素与盐酸胍属中强度变性剂,易经透析与超滤除去。它们对包涵体氢键有较强得可逆性变性作用,所需浓度尿素8-10M,盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱,溶解度为70-90%,尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐,对重组蛋白质得氨基进行共价修饰,但用尿素溶解具有不电离,呈中性,成本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解得包涵体可选用多种色谱法纯化等优点,故目前已被广泛采用。盐酸胍溶解能力达95%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀与对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。包涵体最后得纯化,一般就是离子交换,疏水,或者就是亲与层析,亲与层析尤其就是金属螯合层析用得比较广泛,而纯化得效果也不错,通常就是一步就能达到纯度为95%以上得包涵体。8M高浓度尿素溶解后离心获得得包涵体溶解液,放在4度冰箱过夜后出现沉淀,这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪,后来发现就是我们得冰箱得温控出了问题实验三、关于包涵体得溶解:1、请教GST包涵体溶解<<<<2、包涵体得溶解十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时,可不可以互相代替？可以替换,调pH不久没什么区别了吗;两者得功能团相同,pH不同,前者钠盐便于保存罢了3、有关包涵体得溶解问题强得变性剂如尿素(6-8M)、盐酸胍(GdnHCl6M),就是通过离子间得相互作用,打断包涵体蛋白质分子内与分子间得各种化学键,使多肽伸展,一般来讲,盐酸胍优于尿素,因为盐酸胍就是较尿素强得变性剂,它能使尿素不能溶解得包涵体溶解,而且尿素分解得异氰酸盐能导致多肽链得自由氨基甲酰化,特别就是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等就是去垢剂,可以破坏蛋白内得疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。另外,对于含有半胱氨酸得蛋白质,分离得包涵体中通常含有一些链间形成得二硫键与链内得非活性二硫键。还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体得增溶,有时还原剂得使用也就是必要得,可能由于含二硫键得杂蛋白影响了包涵体得溶解。4、8M尿素溶解得包涵体溶液应如何保存?我在4度放了半个月,目前没出什么问题5、8M尿素溶解得包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?BI溶液在室温放置48小时,可能会对目得蛋白有影响,因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化,因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不就是很清楚。做完裂解之后加TritonX－100轻摇３０min,蛋白溶解得会多些<<<<四、包涵体得复性1、包涵体如何复性包涵体得复性主要有两种方式:1,稀释溶液,但就是操作得液体量大,蛋白稀释2,透析,超滤或电渗透析去除变性剂其中透析很适合实验室应用,但就是时间长。另外,如果蛋白质右两个以上得2硫键,很