核酸的分离与检测从哪儿提取（Where）？怎么提取（How）？提到什么程度（What）？会出现什么问题（Questions）？如何解决（Solution）？核酸提取的原则和基本要求核酸提取的一般过程关键试剂的作用核酸的部分特征核酸提取的常用方法核酸提取经典案例核酸提取的注意事项核酸提取出现的问题及对策核酸提取的相关说明核酸提取的原则和基本要求Principleandsteps核酸提取的一般过程Principleandsteps破碎细胞-方法破碎细胞-来源破碎细胞（来源-方法）抽提核酸除去杂质核酸的纯化核酸样品的保存关键试剂的作用关键试剂的作用关键试剂的作用关键试剂的作用关键试剂的作用关键试剂的作用核酸的部分特征核酸的部分特征1.存在形式2.pH值的影响3.盐影响4.温度影响核酸的常用提取方法常用的DNA提取方法1.浓盐法1.浓盐法2.阴离子去污剂法3.苯酚抽提法4.水抽提法5.沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）5.沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）6.碱变性法核酸提取的经典案例主要案例6.碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA）6.碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA）6.碱变性法-试剂溶液Ⅰ--溶菌液溶液Ⅰ--溶菌液溶液Ⅱ--NaOH-SDS液溶液Ⅱ--NaOH-SDS液溶液Ⅲ--3MOL/LNaAc(pH4.8)溶液大肠杆菌染色体DNA的抽提大肠杆菌染色体DNA的抽提CTAB法提取植物基因组DNA实验程序实验程序核酸提取的注意事项注意事项注意事项（细胞破碎）注意事项（分离与纯化）注意事项（沉淀、溶解）核酸提取的常见问题与对策常见问题与对策问题与对策问题与对策核酸提取的相关说明为什么用无水乙醇沉淀DNA?在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么加NaAC或NaCL?加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用SDS与KAc来处理?为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?为什么用无水乙醇沉淀DNA?在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么要加NaAC或NaCL加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%-15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。（利用氯仿除酚）为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?1.传统的分离方法是用oligo(dT)-纤维素柱分离mRNA用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图Chapter3-2HowtoassayNAMethods分光光度法二苯胺法测定DNA含量定磷法测定DNA在过量（NH4）2•12MoO4存在时，黄色沉淀溶解于过量的磷钼酸盐溶液中。当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再与试剂中其他的MoO42-结合成Mo（MoO4）2或Mo3O8，呈蓝色。该产物在660nm处有最大的光密度峰，其峰值与光密度成正比。求得单位体积的含磷量除以9.0%既可得单位体积RNA的量，或除以9.2%则为DNA的含量（测DNA时）。核酸制品中微量的无机磷，非核酸的有机磷、硅酸盐、铁离子以及酸度过高或偏低都会影响定磷法的测定结果；但其灵敏度高，最低可测到核酸10μg/ml的水平，准确性较好。电泳检测法迁移率与下列因素有关：电泳检测法凝胶电泳，DNA移动距离和分子量关系（缓冲液0.5×TBE,0.5ug/ml溴化乙锭电泳条件1v/cm16小时）迁移率与电泳条件的关系迁移率与琼脂糖浓度的关系迁移率与琼脂糖浓度的关系材料缓冲溶液配制表实验步骤实验步骤【注意事项】核酸的分离与检测核酸的分离与检测