基本知识回顾DNP-脱氧核糖核蛋白RNP-核糖核蛋白真核生物-染色体DNA和细胞器DNA原核生物-双链环装质粒DNA基本知识回顾第一节核酸分离与纯化的设计与原则一、材料与方法的选择核酸的释放DNA与RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。机械法液体剪切法细胞的破碎方法固体剪切法非机械法干燥法溶胞法核酸的分离与纯化：利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。细胞定位与组织分布上的差异核酸与其它物质的差异：物理化学性质上的不同各自独特的生物学特性核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会下降核酸的鉴定1.浓度鉴定：可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。紫外分光光度法：原理：核酸分子成分中的碱基具有一定的紫外线吸收特性。核酸的最大吸收波长为260nm，溶液中核酸的浓度与溶液在260nm紫外线下的吸光度（修正参数：A260－A310）成正比。灵敏度：0.25ug/ml荧光光度法：原理：核酸的荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出检红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。灵敏度：1-5ng2.纯度鉴定：紫外分光光度法DNA：在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8蛋白质（280nm）与酚（270nm）使比值下降RNA（260nm）使比值升高RNA：在TE缓冲液中，纯RNA的A260/A280比值为2.0，但由于RNA二级结构不同，其读数可能在1.8-2.1之间波动。鉴定RNA纯度所用溶液的pH会影响A260/A280读数。2.纯度鉴定：荧光光度法用EB示踪，进行核酸电泳：DNA分子电泳迁移率低；总RNA（三条带）：23SrRNA28SrRNA16SrRNA18SrRNA5SrRNA+tRNA5SrRNA+5.8SrRNA+tRNA3.完整性鉴定(1)凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。DNA：若有降解的小分子DNA，电泳有脱尾RNA：三个条带荧光强度积分应呈特定的比值。(2)其它方法：核酸的保存DNA保存：DNA溶于TE缓冲液（pH8.0）中在-70度可以储存数年；EDTA螯合二价金属离子，可以抑制DNA酶的活性；在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染小量分装保存核酸的保存RNA保存1.可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水中,在-70度至-80度保存2.若以焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA或在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白或氧钒核糖核苷复合物（VRC)，可延长保存时间3.RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去离子甲酰胺溶液，可在-20度长期保存4.小量分装保存双链DNA因固有的结构特点，是一种惰性很强的化学分子。但由于是很长的线性分子，而且缺乏横向的稳定性，因此很容易断裂。尽管基因组DNA因来源、性质以及用途不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分离纯化的原则、主要步骤、主要试剂及其作用原理是一样的。酚抽提法：本法以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。SDS为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质。并使它们沉淀，同时还有降解DNA酶的作用。无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶和细胞中的蛋白质酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性。pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。多次抽提可提高DNA纯度。一般在抽提二至三次后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。酚抽提法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10ug，至多到数百微克的DNA样品。甲酰胺解聚法细胞裂解与蛋白质水解步骤同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性，但对蛋白酶K的活性无显著影响。由于本方法操作步骤少，尤其减少了酚的多次提取，所以获得的DNA分子量一般可以大于200kb。由于需要充分的透析，用该法制备DNA所需时间长而且所得DNA浓度