第五章生物技术原理21世纪是生命科学与生物技术的世纪，生物技术被世界各国视为一项高新技术，广泛应用于农业、工业、医药卫生、食品、化工能源等各行各业，正在对人类社会生活产生深远影响。传统生物技术:酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶第一节基因工程操作原理第二节细胞工程操作原理第三节酶工程第四节发酵工程第五节蛋白质工程第六节分子杂交与遗传标记第一节基因工程操作原理（P133）一、什么是基因工程（一）核酸分子的提取技术（二）电泳技术（三）各种酶的使用（四）基因克隆（五）体外重组（六）载体构建（七）转化（八）重组体的筛选与鉴定（九）培育新型品种分类：（二）电泳技术总RNA第一节基因工程操作原理用质粒构建用噬菌体DNA构建限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子的构建2、DNA连接酶的使用DNA聚合酶可以使单核苷酸通过磷酸二酯键加在寡核苷酸的3′-OH端，在基因克隆中用来补平缺口。尤其是具有耐热性质的DNA聚合酶的分离极大促进了基因等DNA片段的体外合成与扩增技术的发展。4、逆转录酶的使用（四）基因克隆第一节基因工程操作原理利用酵母或细菌制备人工染色体基因组文库，从中克隆基因，如酵母双杂交体系可以分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。第一节基因工程操作原理理想的运载体是质粒，当给它安装一段外来DNA片段后，它依然如故地进行自我复制。（1）农杆菌介导转化法：将外植体放入农杆菌菌液中浸泡，然后转入共培养基，再转入筛选培养基诱导抗性愈伤组织和抗性芽，生根后的抗性植株移栽至营养钵培养。又称微弹轰击法。其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下，微粒被高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。在短时间的高压直流电脉冲的冲击下，可以使原生质膜的分子疏松，形成暂时性的直径为3～4nm的小孔，但对原生质体生活力影响不大。这时，存在于原生质体周围溶液中的外源DNA，就可以通过这种小孔进入原生质体，实现基因的直接转移。世界上主要有4类已报道的方法：1）融合法，包括精子融介法，微细胞介导融合等。2）化学法，包括DNA-磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介导法。3）物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等。4）病毒感染法，包括重组DNA病毒感染、重组RNA病毒感染等。真正成熟方法显微注射DNA法精子介导法核移植法核显微注射法是转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给母畜授精。优点：成本很低，只有显微注射法成本的1／10。由于它不涉及对动物进行手术处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行试验。先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到受体细胞—去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。遗传检测法物理检测法菌落或噬菌斑杂交筛选法免疫化学检测法DNA－蛋白质筛选法转译筛选法等★草甘磷是一种广谱除草剂，将含有抗草甘磷的EP2SP合成酶突变基因引入植物，就可使植物获得抗除草剂特性，使大田作物便于除草，农业操作简便。★在食品工业方面可提高微生物菌种性能，通过基因工程改造的面包酵母中麦芽糖透性酶和麦芽糖酶的含量比普通面包酵母高，产生二氧化碳气体的量也较高，可制作出更松软可口的面包。★凝乳酶传统方法是从小牛胃中提取，成本高，产量低，20世纪80年代以来，将凝乳酶原基因导入大肠杆菌，成功地进行了大规模的生产。★美国基因重组的抗霜菌，洒在植物上可抗霜冻。第一节基因工程操作原理“多莉”轰动了世界；“克隆人”让人匪夷所思；将人类的干细胞加到动物的早期发育胚胎中，导致猪体内流人血，老鼠长着人类脑细胞，小鼠背上长人耳……。细胞工程：按照人们的需要和科学设计改变细胞的遗传基础，并通过无菌操作，细胞融合，核质移植，染色体移植以及组织和细胞培养等技术，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。（一）细胞融合技术细胞融合，又称细胞杂交：是指在离体条件下用人工方法使两个或两个以上的细胞相互接触后，导致细胞合并形成一个新细胞的过程。1、制备原生质体2、诱导细胞融合3、