第二节植物细胞工程第二节植物细胞工程一植物组织培养（Planttissueculture）（一）重要概念愈伤组织的诱导（一）重要概念（一）重要概念（二）对植物组织培养实验室的要求培养室（三）植物组织培养的步骤1.培养基的配制有机营养成分：（配成母液）碳水化合物：蔗糖和葡萄糖，白糖节约成本，一般的使用浓度为2%~4%。植物生长调节物质（常称为激素）：配成母液生长素：NAA、IAA、IBA、2，4-D；细胞分裂素：KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2-iP（2－异戊烯腺嘌呤）和TDZ（噻重氮苯基脲）。其它：赤霉素（GA3）；脱落酸（ABA）；多效唑（PP333）水：（2）培养基的种类：按培养基组成特点分类第一类为含盐量高的培养基，如MS、LS、BL、ER。第二类为硝酸钾含量高的培养基，如B5、N6、SH。第三类是无机盐中等含量培养基，如Nitsch培养基。第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE培养基。按培养基的功能分类脱分化培养基分化培养基壮苗培养基生根培养基初代培养基继代培养基（3）怎样选取最佳培养基方案（例：MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Agar0.6%）对于某个待培养的目的植物来讲：查资料→预备性试验→观察培养物的反应→调整单因子试验，多因子试验和正交设计-----逐步添加和逐步排除基本培养基的选择激素的选择：激素种类、浓度、激素配比糖的选择：糖的种类、浓度的选择琼脂的选择：主要是浓度的选择附加物的选择：香蕉汁、活性炭、椰子汁等（4）培养基的配制方法（药品室进行）MS+6-BA0.5+NAA1+Agar0.6%500mL水+母液：激素或其他成分：如活性碳等糖类：一般30g/L琼脂：一般6－8g/L加热溶化：pH值调整：定容：分注、封口：灭菌：2.灭菌2.灭菌2.灭菌消毒剂因素外植体消毒步骤3.接种（接种室）4.培养Culture（培养室）4.培养Culture（培养室）5.试管苗驯化移栽人工气候室6.试管苗增殖率的估算6.试管苗增殖率的估算葡萄︱葡萄科油樟（樟科）移（四）植物组织培养的主要阶段1.预备阶段①大小适宜：外植体的组织块要达到2万个细胞(即5-10mg)以上才容易活。②同一植物不同部位的外植体的分化能力、分化条件及分化类型有很大差别。③植物胚与幼龄组织、器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量愈伤组织。④不同物种相同部位的细胞分化能力可能大不一样。总之，外植体的选择，一般以幼嫩的组织或器官为宜。此外，外植体的去分化及再分化的最适条件都需进行摸索，他人成功的经验可供借鉴，并无快捷方式可循。（2）除去病原菌及杂菌消毒剂的选择和处理时间的长短与外植体对所用试剂的敏感性密切相关(表3-1)。选择外观健康的外植体，尽可能除净外植体表面的各种微生物是成功进行植物组织培养的前提。通常幼嫩材料处理时间比成熟材料要短些。对外植体除菌的一般程序如下：外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。(3)配制适宜的培养基不同物种，外植体有差异，组织培养的培养基多种多样，但它们通常都包括以下三大类组分：①含量丰富的基本成分，如蔗糖或葡萄糖高达每升30g，以及氮、磷、钾、镁等；②微量无机物，如铁、锰、硼酸等；③微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等。各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。一般较高的生长素(吲哚乙酸)对细胞分裂素(激动素)比值有利于诱导外植体产生愈伤组织，反之促进胚芽和胚根分化。2.诱导去分化阶段但外植体营养吸收不均、气体及有害物质排换不畅，愈伤组织易出现极化现象是固体培养基的主要缺点。如把外植体浸没于液态培养基中，营养吸收及物质交换便捷，但需提供振荡器等设备，投资大，且染菌后难以挽回。本阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长，原则上无需光照。但人们通常还是把它们置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。（乳）白色愈伤组织3.继代增殖阶段继代增殖苗4.生根发芽阶段由愈伤组织分化产生不定芽5.移栽成活阶段第二节植物细胞工程二植物细胞培养（一）细胞悬浮培养2.基本过程：外植体（幼胚、胚轴、子叶等）→培养基→愈伤组织（松散性好、增殖快、再生能力强）或酶解物→震荡培养→大量植物细胞→次生代谢产物3.悬浮培养三个优点：改善营养供应：增加培养细胞与培养液的接触面；避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；可以适当改善气体的交换。4.一个成功悬浮细胞培养体系须满足的条件：悬浮培养物分散性良好：细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。