荧光定量技术和常见问题荧光定量PCR就是什么定量PCR就是如何工作得?与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行:>双链DNA模板变性>引物与模板退火>引物延伸􀃆新得扩增片段在PCR混合液中含有荧光物质。为什么要用定量PCR？1:重复性好2:灵敏度高大家学习辛苦了，还是要坚持3:动态范围宽为什么要用定量PCR？为什么要用定量PCR？定量PCR得化学原理支持得化学试剂Reporter没有荧光信号(发射)Taq酶很特别……SYBR®GreenI化学原理SYBR®GreenI染料得缺点使用熔解曲线Meltcurve(DissociationCurve)检查反应特异性Meltcurve:导数图谱Meltcurve得杂峰多余得峰就是如何产生得?到底用哪一种化学方法呢？TaqMan®,还就是、、、SYBR®GreenI?定量PCR得数学原理怎样获得结果PCR得动力学曲线和四个阶段指数扩增期只有一个扩增期提供高质量得数据基线阈值怎么获得结果怎么获得结果定量PCR得应用定量PCR实验设计和流程---绝对定量和相对定量定量PCR得实验要素相对定量实验实验流程两种相对定量得方法两种方法得区别如何选择相对定量得方法如何选择相对定量得方法如何选择相对定量得方法如何选择相对定量得方法ΔΔCt法ΔΔCt法ΔΔCt法ΔΔCt法结果计算公式含义ΔΔCt法计算示例ΔΔCt法计算示例ΔΔCt法计算示例ΔΔCt法计算示例相对标准曲线法相对标准曲线法绝对定量实验绝对定量实验绝对定量实验绝对定量实验常见问题分析1、扩增效率为什么达不到100%2、扩增效率为什么会大于100%3、实验结果得重复性不好3、实验结果得重复性不好3、实验结果得重复性不好3、实验结果得重复性不好3、实验结果得重复性不好3、实验结果得重复性不好4、其她问题日常实验中得注意事项