文献综述实时荧光定量PCR技术的研究与应用1引言实时荧光定量PCR(real-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[1]。2实时荧光定量PCR技术的原理FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可分为3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。与传统PCR技术相比，它具有特异性强、重复性好、定量准确、PCR污染少、自动化程度高等优点。3实时荧光PCR的分类实时荧光PCR是在扩增产物聚集的过程中连续检测，即实时检测，根据在指数扩增期的产物量来推算初始模板的拷贝数[2]。实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。染料类如SYBRGreenI则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤特异性更高，但后者则简便易行、成本较低。3.1荧光标记探针按其基团标记和能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，大体可以分为水解探针和杂交探针两类。如TaqManTM探针(水解探针)、Dual-oligoFRETpairs(双杂交针)、UniversalprobelibraryLNA(lockednucleicacids(水解探针)、Lux(lightuponextention杂交探针)、Simpleproble探针等[3]。3.2双链DNA(dsDNA)结合染料目前用于实时PCR的dsDNA结合染料，主要有SYBRGreenI和LCGreenTMI[4]。4实时荧光PCR的定量方法在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。由于每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA浓度的标准品可做出标准曲线。4.1绝对定量绝对定量FQ-PCR一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量，可以通过化学合成目的基因；或是将PCR扩增产物直接梯度稀释；或是将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数可准确定量，它的优点是稳定、准确[5]。质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可在标准曲线中定出样品的拷贝数。做好标准曲线至关重要，对于RNA样品,标准品最好是体外转录的RNA，如果用cDNA、PCR产物作为标准品，虽然制备简单易于保存，但是将会因为标准品无法准确指示样品反转录效率，而给最终定量起始拷贝数带来影响。绝对定量也具有相应的缺陷，标准品的稳定保存很难获得成功。目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。4.2相对定量相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素,通常选用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA[6]。使用的β-actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相