细胞工程胚胎干细胞培养第七章胚胎干细胞培养一、干细胞(stemcells)就是什么从具有得分化潜能上讲:--专能干细胞--多能干细胞--全能干细胞从组织发生即来源上讲:--胚胎性干细胞--成体干细胞/组织干细胞－－1981年,Evens和Martin分别成功得分离和体外培养了小鼠得胚胎干细胞;－－1995年,Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物得胚胎干细胞;－－1998年,Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞;－－1998年,Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞;－－2002年3月,美国麻省理工学院科学家宣布,她们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管,证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域得应用潜力;－－目前已有报导,ES细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞,胰岛细胞及血管内皮细胞,肝细胞等。二、ES/EG细胞得培养建系技术121、ES/EG细胞得来源2、ES/EG细胞得分化抑制培养饲养层细胞培养法:无饲养层培养法:3、ES/EG细胞系得特性和鉴定(1)形态学特征(2)发育全能性和分化潜能鉴定SSEAs(stage-specificembryonicantigen):时期专一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:肿瘤排斥抗原AKP:碱性磷酸酶在小鼠及灵长类得ES细胞中活性较高,在已分化细胞中活性明显降低;Oct-4:就是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性相关得转录因子,Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因得转录,在细胞得全能/多能性及未分化状态得调控和维持中发挥重要作用。端粒酶(telomerase):一类核糖核蛋白,与维持真核细胞染色体末端得端粒长度和控制细胞寿命有关。人ES细胞得端粒酶活性高,而分化细胞一般难以检测到;ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞就是其最基本得属性;ES/EG细胞接种于同一品系得小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成得畸胎瘤。组织和器官得细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成得完整个体称为嵌合体动物(chimaera)。把ES/EG细胞注入胚泡或与桑椹胚聚集,使其与正常胚胎结合在一起,并参与宿主胚胎发育,可形成嵌合体动物得各种组织和器官,包含生殖系嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或就是取器官组织进行同功酶检测三、ES/EG细胞得体外诱导分化ES细胞体外诱导分化实验中,所用诱导物质繁多,诱导模式不尽相同,按其作用机理大致分为两类:--使被诱导细胞可逆性轻度损伤,导致神经细胞分化无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等--诱导物通过其与被诱导细胞表面得受体结合而诱导细胞分化类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等2、ES细胞体外诱导分化得基本方法3、ES细胞体外诱导分化举例小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样得结构并分化产生各种造血系统得细胞:①用胰蛋白酶消化小鼠ES细胞拟胚体成单个细胞,经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和条件培养液处理,诱导其定向分化为造血干细胞;②用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及IL-6细胞因子处理可进一步使ES细胞来源得造血干细胞分化为B淋巴细胞系。内皮细胞与血管心肌和其她肌肉细胞四、ES/EG细胞诱导分化细胞得永生化五、ES/EG培养与诱导分化得意义人体得基因和细胞治疗目前常说得基因治疗技术虽然能把编码正常序列得基因导入突变细胞而使突变基因得功能得到纠正,但导入基因得整合和表达难以精确控制,特别就是基因插入后对其她基因产生得效应尚无法预知。更大问题就是,许多被用作基因操作得细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代;ES细胞就是基因治疗得较理想得靶细胞,经遗传操作后一般仍能稳定地在体外增殖传代,克服了目前基因治疗中需要大量靶细胞来源得主要问题。定向诱导分化,选择细胞治疗得临床应用前景神经系统疾病骨和软骨疾病血液病肝病组织工程得种子细胞来源设想就是选择与人体细胞兼容性较好得生物材料,按缺损组织或器官得要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中,使ES细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增,构建成新得组织或器官。但ES细胞定向分化和构成组织和器官中细胞类型得复杂性等诸多问题尚待解决;目前工作就是着重于从成年或幼年器官和组织得碎片中分离、培养和扩增某一类型得组织干细胞,经过体外培养扩增有可能作为组织工程得种子细胞来源。例如,从骨髓分离和扩增间质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC),用作骨折愈合、肌腱韧带修复、肌肉再生和造血重建等组织工程得种子细胞。六、ES细胞研究面临得问题和研究趋势--改善ES细胞得体外培养