PAGE\*MERGEFORMAT2实验四动物细胞传代培养一、实验目的1.掌握消化法细胞传代培养的原理。2.了解细胞传代培养所需专用设备、试剂。3.学习细胞传代培养操作。二、实验原理动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。三、主要仪器与试剂1.实验仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱2.实验试剂及材料：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液、原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞四、实验步骤1.用75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，并过火焰。2.从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，过火焰后吸取2mlPE，于侧壁加入，轻摇后倒掉。3.再加入5mlPE于侧壁，轻摇4-5min，于镜下观察，倒掉。4.加入0.3ml胰酶，扭紧瓶盖，观察，并轻拍。5.大部分细胞脱壁后加入5mlMEM(含10%血清)，吹打形成细胞悬液。6.将2ml细胞悬液移至玻璃培养瓶中，并取3mlMEM，加1mlMEM于玻璃培养瓶中，另外2mlMEM加入到塑料培养瓶中，过火焰，扭紧瓶塞。7.在瓶壁上做标记。8.将传代好的培养瓶放置于37度二氧化碳培养箱中培养。五、实验结果细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）→伸展（铺展）→细胞扁平或呈梭型→繁殖六、思考题1.请结合实验体会简述细胞传代培养成功的标志和显微镜下观察到的现象。（消化前后、游离期、贴壁期、指数生长期等不同时期细胞状态、培养液的清澈度、颜色、细胞界限等），并比较成功与不成功培养及其他培养状态的差别。①传代培养成功的标志：透明度大、细胞内颗粒少、没有空泡，胞膜清晰，胞液清晰透明，悬浮细胞碎片少，培养基澄清且颜色偏黄色，说明细胞生长状态良好且数量较多。②显微镜下观察到的现象：消化前：细胞长满培养瓶底，呈梭形，细胞紧密无间隙。消化后：细胞质回缩，细胞间隙增大，细胞变圆，细胞从瓶壁脱落下来并悬浮和流动起来。游离期：细胞间隙增大，细胞圆球形，细胞悬浮，培养液浑浊呈乳白色。贴壁期：细胞扁平或梭型，透明度较好。指数生长期：培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞密度增大。③成功与不成功培养及其他培养状态的差别：成功培养状态：透明度大、细胞内颗粒少、没有空泡，胞膜清晰，胞液清晰透明，悬浮细胞碎片少，培养基澄清且颜色偏黄色。不成功培养状态：胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒，细胞之间出现空隙，细胞形态不规则。若被污染，当细胞刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反差变大，细胞质颗粒变多，细胞延展性差。随着污染的加重，贴壁细胞脱落，培养基中杂质多，培养液很快变黄，且浑浊。