HPV16型E6基因沉默细胞克隆的建立及深入研究的开题报告一、研究背景和意义：宫颈癌是一种流行于女性的恶性肿瘤，它的主要原因是人类乳头瘤病毒(HPV)感染，其中型别16是最常见的致癌病毒。在HPV16感染的过程中，E6基因是一个具有重要生物学功能的病毒蛋白。病毒E6蛋白可以结合并分解宿主细胞的p53蛋白，使得宿主细胞失去抑制癌症发生的能力。因此，病毒感染的宿主细胞往往表现出失控生长的现象，最终导致宫颈癌的发生。目前研究表明，沉默HPV16E6基因的宿主细胞可以对病毒的致癌作用进行抑制，为研究HPV16感染机制以及宫颈癌治疗提供了新的可能性。因此，本课题旨在通过建立HPV16E6基因沉默的细胞克隆，并对其生物学特性进行深入研究，为进一步的宫颈癌治疗研究提供基础实验支持。二、研究内容：1.构建HPV16E6基因沉默的表达载体，并在宫颈癌细胞系SiHa中进行转染。2.筛选出成功沉默HPV16E6基因的细胞克隆。3.对比沉默和未沉默HPV16E6基因细胞克隆的生长特性以及亚细胞结构特征。4.对比沉默和未沉默HPV16E6基因细胞克隆对DNA损伤的反应。5.研究沉默和未沉默HPV16E6基因细胞克隆的凋亡特性。6.探究沉默和未沉默HPV16E6基因细胞克隆活性氧的水平及其与癌症发生的关系。三、研究方法：1.合成shRNA序列，构建shRNA表达载体。2.在宫颈癌细胞系SiHa中采用脂质体介导的方法进行转染，用Real-timePCR和Westernblot检测细胞中病毒E6基因的表达水平。3.通过克隆盘稀释法选出单个克隆。4.采用细胞增殖分析和MTT实验测定细胞的增殖能力。5.采用光镜、电子镜等技术观察细胞的亚细胞结构。6.利用单细胞凝胶电泳技术(DNAcometassay)检测细胞对DNA损伤的反应。7.测定细胞的凋亡指标，包括AnnexinV-FITC/PI双染法、TerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling(TUNEL)法等。8.测定细胞中活性氧的水平。四、研究预期结果：1.成功构建HPV16E6基因沉默的细胞克隆。2.通过对比沉默和未沉默细胞克隆的生长曲线、亚细胞结构以及对DNA损伤的反应，研究沉默HPV16E6基因对细胞生物学特性的影响。3.研究沉默和未沉默HPV16E6基因细胞克隆的凋亡特性，探究E6基因在癌细胞生长中的作用机制。4.探究沉默和未沉默HPV16E6基因细胞克隆活性氧的水平及其对HPV16感染机制的影响。