华中农业大学２００５届硕士学位论文摘要本研究包括三个部分。１．伪狂犬病病毒多重ＰＣＲ检测方法的建立伪狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ，ＰＲ）是由ａ疱疹病毒科的伪狂犬病病毒（ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ，ＰｒＶ）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种严重传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者。该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。本研究根据基因库中的猪伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）各基因的序列，设计了与ＰｒＶ的ｇＢ、ｇＤ、ｇＥ基因序列互补的３对引物。对样品中的ＰｒＶＤＮＡ模板进行了多重ＰＣＲ扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的３条特异性条带，分别为５４９ｂｐ（ｇＢ）、４２９ｂｐ（ｇＤ）、３６６ｂｐ（鳓。用这３对引物对ＴＫ／ｇＩＶｇＥ。三基因缺失疫苗毒的样品ＤＮＡ模板进行多次多重ＰｃＲ扩增，均能稳定得到与设计相符合的２条特异性条带。敏感性试验结果表明，多重ＰＣＲ可以检测到１０６ｐｇ三基因缺失疫苗毒或７５６ＰｇＰｒＶ野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明，以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒ＤＮＡ为模板进行多重ＰＣＲ扩增，均无任何条带。２．基因芯片技术检测ＰｒＶ的研究选取了猪伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）ｇＤ，ｇＢ，ｇＥ基因（萨，班）、蓝耳病病毒（ＰＥＲＳＶ）０ＲＦ６、圆环病毒ＩＩ（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２、细小病毒（ＰＰＶ）ＮＳｌ、乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）ＮＳｌ的保守片段（２００．３００ｂｐ）和作为内参的猪源看家基因ＧＡＰＤＨ部分片段（２５０ｂｐ）、人Ｂ．ａｃｔｉｎ等片段作为捕获探针并设计了特异性引物，固定在芯片上，制成芯片；编码ＰｒＶ野毒株和ｇＥ‘突变株保守性糖蛋白的ｇＤ，ｇＢ，ｇＥ基因，通过多重ＰＣＲ扩增，产物经过纯化、标记、变性后杂交到制备的芯片上，结果表明ＰｒＶ野毒株和ｇＥ’突变株ｇＤ，ｇＢ均出现阳性杂交信号，然而，在ｇＥ基因缺失的部位（ｇＥ。），ＰｒＶ野毒株出现阳性杂交信号，ｇＥ．突变株不出现杂交信号。ＰｒＶＰＣＲ产物和ＰＲＲＳＶ，ＪＥＶ，ＰＣＶ２，ＰＰＶ的捕获探针闾无非特异性杂交信号。芯片能够最低检测出３．２４ｆｇ的ＤＮＡ模板，其敏感性至少比普通ＥＤ．ＰＣＲ高１０倍。本研究说明基因芯片技术能检测伪狂犬病病毒并鉴别野毒与蚯’突变株感染。３．胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖基因的克隆表达猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（ＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓＰｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ａｐｐ）引起的一种具有高度传染性的呼吸道疾病，是危害当前世界各国养猪业的主要传染病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖是该菌的毒力相关因子，且荚膜多糖的血清型差异及合成的数量决定了菌毒力大小。本实验参考猪胸膜肺炎放线杆菌血清型２型荚膜多糖的基因序列（ＧｅｎｂａｎｋＡＹ３５７７２６）分别设计了三对特异性引物，通过ＰＣＲ扩增，获得了长度分别为１１３７ｂｐ、华中农业大学２００５届硕士学位论文４２９ｂｐ、１１４６ｂｐ的ＣｐｓＡ、ＣｐｓＢ、ＣｐｓＣ三个基因片段，然后将其分别克隆到ＰＭＤｌ８．Ｔ中，经酶切鉴定和序列分析获得了阳性克隆予，再将ＣｐｓＡ、ＣｐｓＢ、ＣｐｓＣ分别插入到原核表达载体ｐＧＥＸ．ＫＧ后，转化ＢＬ２１，在ＩＰＴＧ诱导下获得高效表达，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ检测证实表达产物ＣｐｓＣ有生物学活性，ＣｐｓＡ、ＣＯｓＢ无活性。另外，为了获得能持续表达猪胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖蛋白的细胞系，从而进行多糖与细胞之间功能研究，将ＣｐｓＡ、ＣｐｓＢ、ＣｐｓＣ三个基因分别亚克隆到ｐｃＤＮＡ３．１（＋）上，构建了真核表达质粒。这些结果为荚膜多糖进一步研究奠定了基础。关键词：伪狂犬病病毒；多重ＰＣＲ：基因芯片；检测；鉴别：猪胸膜肺炎放线杆菌；荚膜多糖２华中农业大学２００５届硕士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｔｈｅｓｉｓｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｐａｒｔｓｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇｔｈｒｅｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ１．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅＰｒｖｖｉｒｕｌｅｎｔａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｄｓｔｒａｉｎ．Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ（ＰｒＶ），ａｍｅｍｂｅｒｏｆＡｌｐｈａＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，ｉｓｔｈｅｃａｕｓａｔｉｖｅａｇｅｎｔｏｆＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ），ｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｓｅｒｉｏｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅ