第一节酶和菌体固定化2.固定化酶的缺点:（1）酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。（3）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别(tèbié)是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。4.固定化细胞的缺点：（1）必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。（2）必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性，以阻止副产物的形成。（3）细胞膜、壁会阻碍(zǔài)底物渗透和扩散。二、酶的固定化方法(fāngfǎ)/1.吸附(xīfù)法2．离子交换吸附法这是将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业(gōngyè)上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基（TEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、AmberliteIRA-93、410、900等。阳离子交换剂基，如羧甲基（CM）-纤维素、纤维素柠檬酸盐、AmberliteCG50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。包埋法是将聚合物的单体与酶溶液(róngyè)混合，再借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。1.凝胶包埋法凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子(gézi)中。（1）聚丙烯酰胺凝胶包埋法（2）辐射包埋法（3）其他凝胶包埋法2．微囊化法微胶囊的制备方法：（1）界面沉淀法（2）界面聚合(jùhé)法（3）液体干燥法（4）红血球包埋法（5）脂质体包埋法五、共价键结台法（一）酶分子和载体连接的功能基团从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：（1）酶蛋白N-端的a-氨基或赖氨酸残基的-Ｅ氨基。（2）酶蛋白C-端的羧基(suōjī)以及Asp残基的ß-羧基(suōjī)和Glu残基γ-羧基(suōjī)。（3）Cys残基的巯基。（4）Ser、Tyr、Thr残基的羟基。（5）Phe和Tyr残基的苯环。（6）His残基的咪唑基。（7）Trp残基的吲哚基。（二）载体的选择载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是：（l）一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体。（2）载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。（3）载体必须带有在温和条件与酶共价(ɡònɡjià)结合的功能基团。（4）载体没有或很少有非专一性吸附。（5）载体来源容易，便宜，并能反复使用。第二节微生物，植物(zhíwù)和动物细胞的固定化包埋法：1．聚丙烯酰胺凝胶包埋法2．琼脂凝胶包埋法3．海藻(hǎizǎo)酸包埋法4．卡拉胶包埋法5．明胶包埋法二、吸附(xīfù)法三、不用载体法这是选择(xuǎnzé)适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的一种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60℃，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚后干燥即成固定化细胞。三、动物细胞固定化主要(zhǔyào)载体及固定方法有：包埋法包埋法根据载体与方法(fāngfǎ)不同：第三节原生质的固定化细胞产生的许多代谢产物之所以不能分泌到胞外,原因是多方面的,其中细胞壁对物质扩散的障碍是其原因之一。因此(yīncǐ),若能够去除微生物细胞和植物细胞的细胞壁,就有可能增加细胞膜的透过性,从而使较多的胞内物质分泌到细胞外。一、原生质体的制备(zhìbèi)二、原生质体固定化1.琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法用生理盐水配制3%～4%的琼脂，加热溶解灭菌后，至50℃左右，与等体积的一定浓度(nóngdù)的原生质体悬浮液混合将混合液用滴管滴到一定形状的多孔醋酸纤维素上,置于冰箱或冰盒中冷却凝固，制成固定化原生质体。2.海藻酸钙凝胶固定化法用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度的(3%～6%)海藻酸钠溶液,与等体积(tǐjī)的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀,将此混悬液用滴管或注射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中,浸泡1～2h,制成直径为1～4mm的球状固定化原生质体。3.角叉菜胶固定化法用含有(hányǒu)渗透压稳定剂的缓冲溶液配制一定浓度(3%～8%)的角叉菜胶,加热溶解,灭菌