RT-PCR实验步骤实验材料：水稻叶片的RNA。实验原理：目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。本实验以水稻叶片RNA为材料，检测β-actin基因的表达。实验中设定2个阴性对照：一个不加模板RNA，另一个不加反转录酶，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；同时以叶片DNA为阳性对照，检验PCR试剂和扩增过程是否有问题。实验步骤：RNA抽提1.用TRIzol试剂提取植物总RNA。2.将总RNA稀释到终浓度1μg/μl。3.在0.5ml的无菌eppendorf管中分别加入:TotalRNA0.5-１μgRNase-freeDNaseI１μl(１u/μl)10×DNaseIbuffer1μlDEPC处理的ddH2O5μl4.37℃保温15min,然后70℃保温10min.。反转录反应1.加1μl500μg/mloligo(dT)15primer,涡旋混合，简单离心。2.在65℃加热混合物10分钟,然后室温10分钟，再分别加入下列试剂：5×第一链缓冲液4μl、0.1MDTT2μl、10mMdNTP1μl3.涡旋混合后，简单离心，37℃水浴2min.。4.加2μl200U/ml的M-MLV反转录酶。轻缓混合，37℃保温1h。其总体积应为20μl。5.70℃加热15min终止反应，然后加20μl的ddH2O，cDNA第一链可作为模板用于PCR扩增。6.若要去除与cDNA互补的RNA，可加1μl(2units)的RNaseH，然后37℃保温20min。PCR扩增1.在冰上混合加入下列试剂：cDNA第一链1μlTaKaRaExTaq(5u/1μl)0.5μl10×ExTaqbuffer5μldNTPmixture(2mM)4μlPrimerF(10mM)2μlPrimerR(10mM)2μlddH2O35.5μl2.PCR反应程序Step194℃3min1Step294℃1min，60℃1min，72℃1min，30-40CyclesStep372℃5min1Step44℃forever3.以β-actin作为每个RT-PCR的内在标准，以水代替反转录酶来检测RT-PCR中的DNA污染。所使用试剂：5×第一链缓冲液(GIBCOPartNo.Y00146)100mMDTT(GIBCOPartNo.Y11147)200U/μlM-MLVReversetranscriptase(GIBCOPartNo.28025-021)500μg/mloligo(dT)15primer(PromegaCat.No.C110A9362612)10mMdNTP混合物RNase-freeDNaseI(TaKaRaCodeNo.2215CA)5U/μlExTaqpolymerase和10×buffer(TaKaRaCodeNo.RR001DCA)10μMspecificPrimerFandRSterileddH2O