基因工程及体外表达体系（1）.酶基因工程及体外表达体系第一节概述定义：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。RecombinantDNAtechnologyGenecloningMolecularcloningGeneengineeringGeneticengineering二、基本步骤三、意义基因工程大事记1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、干细胞StanleyN.Cohen“工程鲫”、“工程鲤”多利和它的孩子沃尔小组成功克隆两只恒河猴吴明杰小组：5只克隆猪第二节重要的工具酶一、RestrictionEndonucleasesRestrictionEndonucleases2分类Ⅲ型限制酶在DNA链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点以外。Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性，它要求严格的顺序作为切割点。切点顺序中有一个碱基的变异、缺失或修饰，便不再被水解，因此在分子克隆中常用，它被誉为分子生物学家的手术刀。AgaroseGelElectrophoresis3命名原则从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的几种限制酶，分别表示为EcoRⅠ、EcoRⅡ、EcoRⅤ等。RestrictionEndonucleaseEnzymes4Ⅱ型酶作用特点识别顺序一般为4—6个碱基，通常是反转重复顺序，具有180°的旋转对称性,也称回文结构，palindrome,具有对称结构的DNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从5‘3’）和另一条链上从5‘3’的顺序完全相同。例如，5‘GAATTC3’3’CTTAAC5’RErecognition/cleavagesitearepalindromicDNAsequences,notpalidromicasin“ABBA”.E.x.EcoRⅠ5’GAATTC3’3’CTTAAG5'ThesesitesareDNAsequencethatareidenticalonbothDNAstrands.Q:Whichofthefollowing2DNAsequencesisapotentionalRErecognitionsite?Ⅰ.5’AGTTGA3’Ⅱ.5’GCACGTGC3’Q:Ifshowbelowis½ofaREsite,whatistheDNAsequencefortheremaining½?5’TCA___3’从理论上讲，如果DNA链上的A、T、C和G四种碱基随机分布，根据限制酶识别碱基的个数可估算限制酶的切割几率，同时也决定了它切割DNA后产生的DNA片段的长度。实际上，限制酶对DNA的切割是“全”或“无”。识别4个碱基1/44=1/256识别6个碱基1/46=1/4096识别8个碱基1/48=1/655365Ⅱ型酶切割双链DNA产生的切口(2)在识别顺序的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾巴的粘性末端(cohesiveend)；从5’端切割产生5’端突出的粘性末端。(3)从3’端切割产生3端突出的粘性末端。6限制酶使用中的注意事项对离子强度的要求分为3个级别，即高盐(100mmol/LNaCl)、中盐(50mmol/LNaCl)和低盐(0~l0mmol/LNaCl)。星号活力：限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与其识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性。在实验操作中，限制酶从冰箱中取出后，应立即置于冰浴中，操作时一般是将其它试剂加完后，最后加酶，操作迅速。当反应体系中有两种限制酶时，如何处理。7少数有特殊性质的Ⅱ型酶同尾酶（isocaudarner）：为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序中。这些酶虽来源不同，但它们能产生相同的粘性末端。远距离裂解酶（distantcleavage）:这类酶的识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。它们在某一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割。可变酶：这类酶是Ⅱ型酶中的一个特例，它们的识别序列中1个或几个核苷酸是可变的，并且其识别序列一般大于6个碱基对。二、DNA聚合酶1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其大片段（klenow片段）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的用途klenow片断的主要用途2TagDNA