基因克隆载体定义经过不一样路径将承载外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持DNA分子。也称DNA克隆载体。必备条件1、克隆位点(一个或多个)2、能携带外源DNA片段进入受体细胞:能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。3、有选择克隆子标识基因4、安全性(不含损害受体基因,不任意转入别,尤其人细胞)意义：基因工程随载体系统建立而兴起，构建新载体一直是基础研究优先领域。按克隆载体起源分：质粒～病毒或噬菌体～质粒与病毒或噬菌体DNA组成～质粒与染色体DNA片段组成～３.１质粒克隆载体定义：以质粒DNA为基础构建而成载体，适于原核和植物基因转移、建立基因组文库和cDNA基因文库。构型：２、分子大小：100～102kb复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）（１）每种质粒在其宿主细胞内拷贝数相对稳定严紧控制型：1~数个拷贝；大质粒松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。（２）质粒复制控制原因cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒继续复制。rep基因：指令宿主合成一个调整蛋白，促进质粒复制４、质粒不亲合性亲和性质粒：能在同一细胞中复制几个质粒不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制质粒意义：宿主细胞内原有质粒与克隆载体质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒５、质粒迁移（１）接合质粒：含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞含tra基因质粒称为接合质粒。如F、Ti等不含tra基因质粒称为非接合质粒。如ColE1、pPbS等（２）迁移作用不含tra基因而含bom（oriＴ）位点质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非结合质粒借助接合质粒tra基因产物而迁移入受体细胞。这种现象称～６、显性质粒和隐蔽质粒宿主因含某种质粒而展现出新性状，称为显性（表示型）质粒。显性质粒Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药品抗性基因，可作为选择标识。Col质粒Ｆ质粒降解质粒Ｔi质粒隐蔽质粒蓝藻内源质粒二、质粒克隆载体构建基础策略１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝）２、克隆位点——组装MCS连杆３、选择标识基因——抗性基因，LacZ’基因４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓５、组装各种“元件”，如开启子、终止子等三、质粒克隆载体构建过程：严密试验设计→构建（切割、修饰和连接重组）构建标准1、选取适当出发质粒：含必备元件，如ori、选择标识、克隆位点、开启子和终止子2、正确取得构建质粒克隆载体元件3、组装适当选择标识基因4、选取适当开启子5、构建过程力争简单代表性实例。（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体构建Ⅰ、pBR322构建质粒载体命名法则“pBR322”p：质粒（plasmid)BR：两位主要构建者322：试验编号pSC101（最早用于DNA克隆载体），严紧型ColE1松驰型，筛选系统复杂基因克隆载体构建过程(出发质粒：pMB1)R1（沙门氏菌中分离）变异R1drd19（含易位子Tn3Apr）R1drd19Tn3pSF2124ColE1pBR322三个亲本：pMB1、pSF2124、pSC101识别位点：Apr基因区（3个）：PstⅠ、ScaⅠ、PvuⅠTcr基因区（7个）：BamHⅠ、ScalⅠ、EcoRⅤ、SphⅠ、NheⅠ、NruⅠ、XmaⅢTcr开启子区（2个）：ClaⅠ、HindⅢpBR322分子大小：4363bp基因克隆载体基因克隆载体3、优点（1）较小分子量10kb以内DNA分子纯化过程中可防止断裂，pBR322易于本身纯化，且可克隆6kb左右外源DNA（2）较高拷贝数经氯霉素扩培后达1000～3000copys/cell（3）含有两种抗菌素抗性基因可供作转化子选择标识。插入失活（图解）基因克隆载体Ⅱ、pUC18/19质粒载体与pBR322区分：乳糖操纵子一个DNA片段（lacZ`基因）替换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆命名pUC——UniversityofCalifornia科学家首先构建。图3-3。pUC包含四个组成个别：（1）pBR322复制起点(ori)（2）Apr基因，但DNA序列发生改变，不再含原来限制性核酸内切识别位点（3）lacZ`基因（4）在lacZ`基因内部靠近5`端有一段