现代组织化学技术(ModernHistochemicalTechnology)华中科技大学同济医学院解剖学系组织胚胎学教研室现代组织化学的内容1、经典组织化学2、免疫组织化学3、电镜与免疫电镜组织化学4、原位杂交组织化学组织化学（Histochemistry）一、组织化学的基本概念（三）组织化学的基本原理（四）组织化学技术的基本要求☆10%中性缓冲福尔马林：甲醛实际浓度为4％[甲醛原液10ml,0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)90ml混匀]☆4%多聚甲醛[（HCHO)n，n=8~100]：多聚甲醛40g,0.1mol/LPB500ml，两者混合加热至60℃，搅拌并滴加1mol/LNaOH至溶液清澈，补充0.1mol/LPB至总量1000m1☆PB和PBS是最常用的缓冲液，0.01mol/LPBS主要用于漂洗组织标本、稀释抗体和血清等。0.1mol/LPB常用于配制固定液及蔗糖等。3）乙醇：CH3CH2OH1、石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（梯度酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（石蜡切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（梯度酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序石蜡切片：组织取材和固定（甲醛）→脱水（酒精）→透明（二甲苯）→浸蜡（石蜡）→包埋（石蜡）→切片（切片机）→粘片（载玻片）→烤片（烤箱）→组织化学染色程序前的处理→组织化学染色组织化学染色程序前的处理:→脱蜡（二甲苯）→纯酒精置换二甲苯→梯度酒精入水→组织化学染色程序→常规脱水、透明、封片2、恒冷箱切片组织取材和固定或不固定→骤冻（液氮，–198℃；干冰，–78℃；冻结金属座，–30℃）→切片（恒冷箱）→粘片（载玻片）→晾片→组织化学染色程序→常规脱水、透明、封片能够完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶的活性，以及抗原的免疫活性（注意抗体的选择），能够很好地保存脂肪、类脂等成分步骤更简单，快速、省时冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，破坏组织细胞的形态结构，造成抗原的弥散，从而定位不准确组织过大不容易冻结或组织冻结不均，影响切片及染色效果。不容易制作较薄的切片，不容易做连续切片，不容易长期保存糖类显示法脂类物质显示法常用核酸组织化学Feulgen反应显示DNA吖啶橙染色显示DNA和RNAmethylgreen-pyronin为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿：与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色派洛宁：与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色Hoechst33258和Hoechst33342显示DNADAPI显示DNAconfocalimagesofnuclearethidiumbromide(EB)staining吖啶橙能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴化乙锭仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS暴露在细胞膜表面。在Ca2+存在时，AnnexinV与PS有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS外翻发生在细胞核破裂、DNA片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得AnnexinV与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。PI被用来区分存活的早期细胞和坏死或