2024/9/15234567〔方法〕标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）厚6微米。固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃2~5′①切片标本入下列孵育液中，37℃，5分钟孵育液：3％β—甘油磷酸钠6ml底物保2％巴比妥钠6ml调PH证2％氯化钙（无水）9ml沉淀剂新2％硫酸镁6ml激活剂鲜蒸馏水3ml30ml将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。②流水流水洗2分钟后→入蒸馏水③入2％硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟）置换Ⅰ④流水洗5分钟，入蒸馏水。⑤入0.5硫化胺，2分钟。置换Ⅱ⑥流水洗10分钟，入蒸馏水。⑦入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟⑧流水洗5分钟→蒸馏水。⑨甘油明胶或Apathy糖胶封固。结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛纹状缘和血管内皮出现黑色的硫化钴沉淀，显示ALP活性强。△ALP为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、乳腺及卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。〔对照〕①无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3％β—甘油磷酸钠，其余各步进行同上。②加热灭活酶活性。③加抑制剂，左旋咪唑0.1～1.0mmol/L〔注意事项〕①〔Ca2+〕要足量②硫化钠（NH4）S配置成淡黄色，可提供S2-〔滴2～3滴〕③用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性。④有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色素）出现，可影响结果。★本法可用显示：5—核苷酸酶、肌蛋白ATPase、ALP二、铅法——显示酸性磷酸酶（Gomori，1950Lojda，1979）※ACP的特性①PH4.5～5.5适宜②激活剂：Mn2+③抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。〔ACP定位〕①溶酶体（颗粒状）内；②溶酶体外ACP存在于ER和胞液。③该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。〔方法〕标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可用甲醛，但影响活性。本实验不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液，4℃，2～5min步骤：①将标本放于下列孵育液中37℃，10～15′孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH5.215ml0.24％硝酸铅15ml3％β—甘油磷酸钠3ml33ml混匀，置37℃水浴中15～30分钟后，过滤。②于37℃蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温蒸馏水洗）③入5％硫化胺，1～2分钟。④流水冲洗3～5分钟后，换蒸馏水。（可用Mayer苏木素复染核）⑤用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。〔结果〕酶活性部位→棕黑色硫化铅沉淀。分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。〔对照〕孵育液内加0.01MNaF（13.9mg/33ml）→（—）〔注意事项〕①铅离子的浓度→关键问题，没有底物，有些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF抑制酶活性→排除假阳性反应。②孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。［应用范围］“铅法”适用于：ACP，5’--核苷酸酶G—6—P酶;膜ATPaseMito—ATPaseTTPase（硫胺素焦磷酸酶）三、偶氮偶联法显示ACP［原理］以奈酚的衍生物磷酸脂NaphtholAS—BLPhosphate为底物，在酸性PH（5.2）下，经酸性磷酸酶水解释放出NapholAS—BI，立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。［方法］标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液内，4℃，2～5min①标本入下列孵育液，37℃，30～60分钟。孵育液：磷酸奈酚AS—BI15mg溶于二甲基亚砜0.6ml六氮化对品红缓冲液30ml30.6ml充分混匀并过滤②蒸馏水洗③入Mayer苏木精内染1分钟。④流水冲5分钟后入蒸馏水。⑤用Apathy糖胶或甘油明胶封固。［结果］酶的活性部位呈红色，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。※ACP是溶酶体的标志酶。※※六氮化对品红液的配制（30ml）①4％对品红盐酸溶液碱性品红400mg浓盐酸2ml蒸馏水8ml②4％NaNO3配好后于冰箱保存用时取1ml。①+②等量混匀（各取1ml），盖严并置室温静止一分钟，待混合液变为淡黄色→倒入28ml2.72％醋酸钠溶液，用1NNaOH调PH至5～5.5即成。四、四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶［原理利用］利用H受体的H2，使四唑还原成甲月替：反应式如下：本实验：以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（nitroBT）为受H体，其接受H后被还原成甲月替