日程•原理•数据处理•SDS软件、RQ软件•应用开发指南•试剂应用、网上查询方法•故障排除、手册下载方法•SNPBrowser•CDS•交流讨论1定量PCRi：技术原理陈云地8008100192，021-64736366-407chenyd@appliedbiosystems.com2004年2内容提要™基本概念™定量PCR的数学原理™定量PCR的化学原理™硬件性能™软件系统3定量的基本概念两种定量目标绝对定量相对定量“600个拷贝”“增加10倍”5标准曲线方法标准品未知样本6CT值对拷贝数的曲线1250copies2500copies5,000copiesCT=24.810,000copies20,000copies浓度=4000拷贝PCR的基本概念PCR原理链式反应的雪崩效应5'3'5'5'3'3'5'forwardprimer5'5'3'5'3'5'5'3'5'3'3'5'5'reverseprimer5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'5'3'3'5'3'5'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'9PCR理论方程nN=N0x(1+E)N:扩增子数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数10PCR动力学曲线11PCR分期平台期Plateau线性增长期LinearLog[DNA]y=x(1+e)n指数增长期Geometric循环数12定量PCR的基本概念两种定量方法“产生了6000000000个拷贝”终点定量线性图谱半对数图谱起点定量“加进去600个拷贝”14两种定量方法终点分析：没有严格规律对数期分析：平行性好15两种定量方法终点产物数量：误差太大同一个样品重复96次PCR实验拐点产物数量：重现性好16对数期定量的优势z起始DNA量，更具意义z重现性好，误差小z扩增效率恒定，标准曲线呈线性17实时荧光PCR的基本概念实时荧光定量PCR通过PCR来测定样品中的核酸数量通过荧光来检测PCR，双倍放大模板可以是DNA或者RNA123456789101112logmolecules19用荧光检测PCR产物SYBRSYBRGreenGreenII•荧光标记扩增产物•动态监测荧光信号变化•荧光标记引物•特异性荧光标记探针TaqMan探针、分子信标、杂交双探针TaqManTaqMan•荧光染料直接结合扩增产物SYBRGreenI与DNA双链结合释放荧光信号20荧光信号的产生荧光基团在激发光作用下，产生波长更长的发射光21“实时PCR”指不开盖测定核酸闭管化学(污染的风险低)没有PCR后处理(无需走胶、拍照等)高度自动化lens定性：单数据点测定定量：多数据点测定能做基因分型及SNP鉴定22TaqMan®的技术优势PipetReadSamplesResultsNoBlots!NoGels!23定量PCR的数学原理起点定量的关键：CT值CT值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过阈值线)时的循环次数线性图谱半对数图谱CT值CT值25为什么CT∝起始DNA浓度?nRn=RB+X0(1+E)Rs总信号=本底信号+分子数量×单位信号强度Rn第n个循环时的总信号RB本底RS单位信号强度X0起始DNA数目EPCR效率26为什么CT∝起始DNA浓度?nRn=RB+X0(1+E)Rs当循环次数n=CT值时：CTRT=RB+X0(1+E)Rslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRslogXOlog(RT−RB)−logRSCT=−+log(1+EX)log(1+EX)即CT=-klgX0+b（线性方程）27CT值-X0作图CT=-klogX0+bCTX0手工操作方法：阈值决定CT值阈值CT阈值=基线信号的标准偏差x1029手工操作方法：基线决定阈值基线范围第3个循环-阈CT值前3个循环标值基线范围准高偏度一般取3-15(进口试剂)差或6-1