·78·(总第136期)水利渔业2004年第24卷第6期鱼源气单胞菌的分离鉴定及血清学调查*董传甫，林天龙，俞伏松，陈日升，龚晖，陈振海(福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013)摘要：应用生化鉴定和PCR技术对1999-2001年主要分离自福建省患典型败血症鳗鲡的气单胞菌进行精细的鉴定，结果共得到气单胞菌115株，其中嗜水气单胞菌69株，温和气单胞菌29株，豚鼠气单胞菌2株和未定种气单胞菌15株。45株可被典型分型于5个主要血清型；福建鳖源嗜水气单胞菌优势血清型为0：Ah10501，鳗源气单胞菌分离株主要分布于O：Am0501、O：YT一1、0：CHS一3和O：CQ一1等4个血清型。非福建分离株则集中分布在0：l9617(0：9)。LPSs免疫印迹法既能用于不同血清型菌株脂多糖的结构分析，又能对常规血清学分型结果进行校正，其结果更直观、准确。关键词：气单胞菌；分离；鉴定；血清型；脂多糖；免疫印迹中图分类号：$941．42文献标识码：A文章编号：1003—1278(2004)06—0078—04运动气单胞菌MotilegenusAermonas对水产养殖业1材料与方法的危害已得到普遍的认同[1-3]，对由致病性气单胞菌所引发疾病的有效防治成为水产养殖成功的关键因素之1．1细菌来源一。已有的研究表明。气单胞菌的暴发和流行总是表现本研究的细菌主要为本研究室自行分离鉴定，分离为一定的优势血清型[2-5]。而气单胞菌的优势血清型又源主要集中在福建省的长乐、福清、连江、莆田等主要鳗与其寄生的宿主、宿主周边的环境条件都有一定的关鲡养殖场患败血症的养殖欧洲鳗鲡或日本鳗的病灶处，系l5]。精确的血清学定位有利于及时把握病源流行动少量菌株分离自患病中华鳖和其他发病淡水养殖鱼。非态，且对于有关疫苗的制备和应用具有重要的指导意义。福建分离株见表1。嗜水气单胞菌参考菌株Ah10501购国际上于20世纪80年代中后期至90年代中期对主要来自北京陆桥公司，温和气单胞菌CI9—11购自中科院水自临床人源分离株和环境源分离株进行了较为系统的血生生物研究所，ATCL'7966由浙江省淡水研究中心钱冬先清学分型研究，国内则比较关注气单胞菌对水产养殖业生提供。的危害，但较大规模的血清学分型试验却鲜有报道。福1．2细菌的分离与鉴定建省地处亚热带，是水产养殖大省，特别是鳗鲡和中华鳖1．2．1细菌的生态及生化鉴定常规方法对分离细菌的养殖在国内占有重要的地位。近年来，有关气单胞菌进行革兰氏染色，革兰氏阴性菌做进一步的氧化酶试验引发养殖鳗鲡的细菌性败血症也多有报道，最常见的由和更为详细的生化鉴定。生化鉴定参考《新编革兰氏阴致病性嗜水气单胞菌Aeromonash3drophila引起的鳗鲡性菌鉴定编码手册)[]上的21项生化指标辅以七叶苷水败血症表现为体表充血乃至溃烂、血性腹水、胃内积水、解、葡萄糖产气和O／F试验；动力实验为：接种细菌于半肠炎、肝脾等组织败血等系列严重病变[·7l，每年都能引固体培养基中，30℃隔夜生长后判断其生长情况。其它起养殖鳗鲡的大批量死亡。本研究对主要分离自患典型生化试验及其结果判定参照产品说明进行(微量生化管败血症的鳗鲡和发病中华鳖的气单胞菌进行较为精细的主要购自杭州天和生化试剂公司)。根据生化鉴定的结鉴定并对其进行血清学划分，试图把握该菌在本地区流果对照《新编革兰氏阴性菌鉴定编码手册)判定细菌的种行状况，为有关疫苗的研究和应用打下基础。类。1．2．2细菌的PCR鉴定法PCR扩增嗜水气单胞菌的收稿日期：2004—02—19气溶素／溶血素基因aerA，参考Pollard等L9J的方法进行。基金项目：福建省科委资助项目(NO．2000Z077)上游引物：5’一CcAA0G~ACA一3’，下游*林天龙为通讯作者。华中农业大学水产学院陈孝煊副教弓I物：5’一，工vIv】℃ACCG(AACAGGATG一3’。授、珠江水产研究所吴淑勤研究员、福建省农业科学院生物中心1．3血清学分型郑伟文研究员、浙江淡水研究所钱冬副研究员和我们交流了部分1．3．1抗原制备常规方法制备全菌抗原(WC—Ag)和菌株，钱冬先生还惠赠0：9和0：5两份抗血清，作者在此深表谢0抗原(0一Ag)。意!1．3．2抗血清制备用灭菌生理盐水将上述全菌抗原作者简介：董传甫，1975年生，男，河南南阳人，硕士，研究实习员，和0一抗原稀释到0／)6o0：1．0(约为0．8×10)，按常规2004年第24卷第6期水利渔业(总第136期)-79·程序免疫家兔后的第7天，耳缘静脉采血，试管凝集法测一8012冰箱备用。其效价，凝集效价在l：640以上时心脏大