会计学/基因工程的单元操作过程如下：（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开。（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成(xíngchéng)DNA重组分子。（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整含到受体细胞的基因组中。（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。关于限制性内切酶Restrictionendonueleases限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列(xùliè)并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000种以上，搞清识别序列(xùliè)的有300种以上。有关限制性内切酶发现的几个重要实验50年代初，Luria和Human在研究T4噬菌体感染作用、Bertani和Weigle在研究和P2噬菌体与宿主(sùzhǔ)细胞关系时，发现了细菌内限制与修饰现象。发现了细菌内存在限制修饰系统，在这两个系统中包括限制酶和修饰酶。限制酶能识别并降解与自身无关的外源DNA，而修饰酶则可通过甲基化修饰自身DNA，免被限制酶降解。实验表明，这种限制的本质是宿主细胞K12中存在有能使外来DNA(•CDNA)有限降解(jiànɡjiě)的核酸水解酶。此后，又进一步证实了大肠杆菌K12中的修饰体系即为甲基化酶，该酶修饰了•K12DNA上的特异部位，使其不被限制体系的酶切割。1965年阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在(cúnzài)着一种具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分离出I型限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在(cúnzài)两种不同功能但又相关的酶。1970年史密斯从流感噬血杆菌d株中分离出了II型限制性内切酶；同年内森斯使用该酶降解猕猴肿瘤病毒SV40的DNA，首次完成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从此成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶，推动了基因工程的发展。1978年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔奖。阿尔伯(1929～)瑞士(ruìshì)微生物遗传学家限制(xiànzhì)性内切酶命名规则限制(xiànzhì)酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌有株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。如EcoRI来源于Echerichia.coliRY13BamHI来源于B.amyloliquefaciens限制性内切酶分类已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：I、II、III型。他们在酶反应中所需要的辅因子和切割DNA的位点都不相同，而且(érqiě)酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。类别/二、II型限制(xiànzhì)性内切酶的特性II型限制(xiànzhì)酶的识别特异性回文识别序列II型限制(xiànzhì)酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构,或称回文序列(PalindromicSequence)非典型回文识别(shíbié)序列非回文(huíwén)识别序列也有些限制酶识别序列非回文(huíwén)结构，切割位点在距识别序列5至13个bp处。识别(shíbié)序列的长度与剪切频率限制酶的切割特异性和酶切片(qiēpiàn)段的末端结构/粘性(zhānxìnꞬ)末端有没有例外？（1）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段A）含多重识别序列的限制酶如HindII在顺序GTPyPuAC剪切，可产生3种不同类型片段，互相连接(liánjiē)的可能性为1/3。B）含非典型识别序列的限制酶如EcoNI在顺序CCTNNNNNAGC剪切，N可以是任何核苷酸，由于N的随意性，往往会产生不广泛匹配的片段。C）在次理想条件下，限制酶表现出星状活性，影响正常匹配。（2）不同的限制性内切酶有时可以产生匹配的片段例：BamHIGGATCCBclITGATCABglIIAGATCT这类能产生相同粘性末端(mòduān)而识别特异性不同的限制酶称作同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶产生的DNA片段可借DNA连接酶互相重组，但新产生的杂合序列将不再被原有的限制酶所识别。5’-GGATCT-3’DNA5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’连接酶3’-CCTAGA-5’(BamHI片段)(BglII片段)(产生杂合识别序列)酶反应条件按手册或商