刺山柑热休克蛋白基因克隆及原核表达的中期报告本研究旨在克隆刺山柑（Citrustrifoliata）中的热休克蛋白基因（HSP）并进行原核表达。在前期研究中，我们通过PCR技术从刺山柑基因组DNA中扩增出了目标基因，并进行了测序验证。本中期报告主要介绍了基因的克隆和原核表达的进展情况。一、基因的克隆1.重组质粒构建将PCR扩增出的目标基因（包含完整的编码序列）连接到pET-28a(+)载体上，构建表达载体pET28a-CtHSP。此后，利用限制性内切酶对该重组质粒进行鉴定，经酶切分析得到理论上的核酸片段大小并进行验证。2.基因序列分析和验证将克隆基因及载体进行双向测序，分别与NCBI的同源物种进行比对分析。通过测序数据分析，确保所克隆基因序列无误，符合目标基因序列。二、原核表达1.诱导表达的优化将克隆的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并进行不同的诱导浓度与时间的优化实验，以使表达达到最优效果。通过Westernblot和SDS-PAGE分析培养物中的蛋白质表达量，并初步确定最佳的诱导条件为0.1mM的IPTG在30℃下的诱导12小时。2.表达蛋白纯化将表达的蛋白质进行纯化，目前采用的是亲和层析纯化方法。纯化出的蛋白质经SDS-PAGE和Westernblot鉴定，分析其分子量和纯度，初步得到了可供进一步鉴定分析的蛋白质。综上，本中期报告对刺山柑热休克蛋白基因的克隆和原核表达进行了简要的介绍和分析。后续工作将进一步进行蛋白结构和功能分析，以及热休克蛋白在植物环境胁迫下的响应研究。