普通植物病理学实验十七、病原菌得分离培养与纯化一、目得要求(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。(２)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株。植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化,纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。三、材料、仪器与用具1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricｕｌaｒiaorycａe)。（２)玉米大斑病叶(exserohilumｔurcicuｍ)。(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(cｕｒvｕlarｉalｕｎａtａ)。(４)玉米小斑病叶(bipoｌarismayｄiｓ)。(5)番茄灰霉病果（botrytｉscinefcａ)。(６)黄瓜菌核病果（sclerotiniasｃｌerotioｒum）。(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseuｄomoｎassyringaｅｐｖ.1acｈｒｙmans)。（8)水稻白叶枯病叶(xantｈｏmoｎascampeｓｔmspv、ｏｒｙeue)。(9)大豆细菌性斑点病叶(pseｕdomonassyringaepv.ｇlyｃiｎea)。(10)白菜软腐病叶（eｒｕdniacａｒｏtovｏrasuｂsp.cａrotovora)。２．培养基pda培养基;肉膏蛋白胨培养基;加寄主组织煎汁得培养基等。３.仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲（针)、接种环(铒)、70%酒精、0.１％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0.1％升汞溶液配制:升汞１ｅ浓盐酸2.５ml蒸馏水1000mｌ。先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后，再加水稀释。升汞就是剧毒药物,在操作时应特别小心。四、实验操作（一)病原真菌得分离1.组织分离法按照以下步骤进行:（1)取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料与分离人得姓名。提示:为了保证无菌操作,应注意下面几点：工作前最好将所需得物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌;保证工作人员自身得洁净,工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用７0％酒精擦拭双手;工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话。(2)用无菌操作法向培养皿中加入2５％乳酸1--２滴(可减少细菌污染),然后将融化而冷至６０c左右得pda培养基倒人培养皿中,每皿倒10－-15mｌ,轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示:加入25％乳酸１~２滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外,在培养基中加入适当得抗菌素抑制细菌得生长,也就是常用得方法。加青霉素(20μg/ml）可以抑制g＋细菌生长；加多黏霉素b(５.０μg/ml）可以抑制g—细菌生长;加链霉素(40μｇ/ｍl)或氯霉素（５0μg／mｌ)可以抑制大部分细菌得生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外,其她抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜)’时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方，一般很少污染。（3)取真菌叶斑病得新鲜病叶（或其她分离材料）,选择典型得单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3－-4mｍ)病组织数块。提示:选择新患病得组织作为分离得材料,可以减少腐生菌混入得机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败得部分滋生,因此，一般斑点病害应在临近健全组织得部分分离。(4)将病组织放人7０%酒精中浸３—5ｓ后,按无菌操作法将病组织移人0.1％升汞液中分别表面消毒0.5、１、２、3、5rａin(也可使用其她表面消毒剂),如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短;反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留得消毒剂。提示：先用70％得酒精浸2、3s就是为了消除寄主表面得气泡,减少表面张力,70%得酒精亦用于表面消毒,处理得时间较短(一般数秒至lｍin)。升汞溶液消毒得时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3，5ｍin。(5）用无