DNA合成常见问题解答Q：如何保存引物或探针产品？A：干粉的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年左右,4℃可以保存6个月左右；溶解好的引物在-20℃下可以保存半年左右,4℃可以保存1个月左右。荧光标记的探针请避光保存。Q：引物在常温下运输，会降解吗？A：不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天左右，所以您收到的引物不会降解。Q：如何计算OligoDNA溶液的浓度？A：基本参数及计算公式：MW(分子量)=(A碱基数x313.21)+(G碱基数x329.21)+(C碱基数x289.18)+(T碱基数x304.2)+(Mix碱基数x324.5)+(I碱基数x314.19)+(U碱基数x290.17)-61.96Mix为兼并碱基；I为2'脱氧尿嘧啶；U为2'脱氧尿嘧啶兼并碱基代码：R=(A/g)、M=(A/C)、W=(A/T)、S=(C/g)、Y=(C/T)、K=(g/T)、H=(A/T/C)、B=(g/T/C)、D=(g/A/T)、V=(A/C/g)、N=(A/C/g/T)平均分子量：OligoDNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条OligoDNA的平均分子量=碱基数x324.5.1OD的OligoDNA约为33ug举例：您得到一管标为2OD20merOligoDNA，无兼并碱基、I和U，序列为：CTGGAGAGAGGTTTGTCTGG分子量=(3x313.21)+(9x329.21)+(2x289.18)+(6x304.2)+(0x324.5)+(0x314.19)+(0x290.17)-61.96=6244.10质量数=2x33=66μg摩尔数=66/6244.10=0.011μmol=11nmole若加双蒸水200μl溶解，则浓度为11nmole/200μl=0.055μMQ：如何测定引物的OD值？A：用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。Q：如何计算引物的Tm值？A：我们推荐对不同长度的引物使用以下方法计算TM值：If>=15碱基Tm=81.5+16.6*log[Na+]+0.41*(G+C)%-500/length([Na+]=0.5M)If<15碱基Tm=4*(G#+C#)+2*(A#+T#)Q：如何制备双链DNA?A：①用退火缓冲液（10mMTrispH8.0,50mMNaCl,1mMEDTA）溶解单链DNA，浓度为1-5OD/100μl。②将两条互补单链等摩尔数混合。③94℃温浴2-5分钟，然后缓缓冷却到室温（25℃以下）。④4℃保存备用。Q：普通合成的引物末端带磷酸基团吗？A：化学合成的DNA是不带磷酸基团的，它的5’末端和3’末端均为羟基。如您需要带磷酸基团，请在合成订单表中注明它的位置(5'末端或3'末端)，需另外收费，见特殊修饰表。Q：2OD的引物可以多少做次PCR反应？A：一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物至少可以做400次左右PCR反应。Q：合成的引物多次PCR无目的产物是什么原因？A：如果PCR后无目的产物，可以从以下几方面寻找原因：①引物设计是否合理。②引物和模板是否配对或同源性有多大。③PCR反应试剂是否存在问题：模板DNA、DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs等。④PCR仪是否正常工作。⑤退火温度及其它反应条体是否优化。⑥模板是否存在复杂结构：GC含量高、重复序列等。影响PCR失败的因素很多，可从多方面分析考虑，若仍然扩增不出带，可要求我公司重新合成OligoDNA，以排除合成因素的影响。Q：PCR产物经克隆后测序发现OligoDNA处碱基有误是什么原因？A:①PCR过程的错配：DNA聚合酶忠实性低、循环数太多、四种dNTP的浓度不同都可能导致在PCR产物序列中OligoDNA错误。②克隆过程中引起的突变。③测序导致的错误。④合成仪管路的瞬时阻堵，结果引起单个碱基或一部分碱基缺失。⑤碱基在偶联到DNA片段之前，碱基与碱基之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片段上，导致多碱基现象。⑦合成过程中出现脱嘌呤，对脱嘌呤后的碱基，DNA聚合酶不能识别，可能导致PCR后出现A或G缺失。⑧脱保护不完全导致碱基缺失。⑨Capping反应不完全，截断DNA（n-1）继续参与后续合成，导致缺失碱基。出现以上情况的概率极低，您可以通过多挑几个克隆得到