一、基因克隆的策略正向遗传学是指通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。功能性克隆(functionalcloning)、表型克隆(phonetypicalcloning)等，如：遗传病基因的克隆。反向遗传学的原理正好相反，首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找有关的表型变化。如：基因剔除技术、转座子标签技术等。图位克隆？简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化结构基因组学的研究为反向遗传学研究提供了大量的待鉴定的基因序列，因此反向遗传学研究也成为功能基因组学研究的一个重要手段。1.功能性克隆(functionalcloning)1.1纯化后克隆若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因，除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5′端的引物合成，根据mRNA3′端poly-A序列指导合成poly-T的3′端引物，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物物中合成相应的cDNA，将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。1.2同源性克隆生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列，基于此原理，在其它种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列制备同源探针，经标记后从相应的文章中筛选阳性克隆，并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因，当然在没有全同源探针的情况下，可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。2.表型克隆(phonetypicalcloning)2.1递减杂交(substractivehybridization)由Lamar和Palmer在1984年提出，作为较早运用研究差异性表达基因的手段，其主要思路如下：从实验组和对照组细胞中抽提mRNA，逆转录成cDNA后，用限制性内切酶切割成片段，并将对照组cDNA片段用S1核酸酶切平，然后以数种限制性内切酶将其切成很小的片段，在一定条件下，用大大过量的实验组cDNA与对照组cDNA相混合，经变性再复性，使来自对照组小的cDNA片段与实验组中的长链cDNA杂交，以选择性除去二者间的杂交体。这样，在实验组表达而在对照组中不表达的目标基因被富集并可被分离，将这些保存有粘性末端的目标基因同质粒或噬菌体相连接，从而构建出减数文库，并可使用探针从文库中筛选出实验组特异表达的基因，常应用于癌基因和抗癌基因筛选，其主要缺点是：操作耗时长，工作量大，难度较大且可能存在着基因缺丢失的现象。2.2差异显示PCR(mRNAdifferentialdisplay—DD，DDRT-PCR)1992年由PengLiang和A.B.Pardee等率先使用，在核酸分子水平上显示了mRNA表达水平的差异。其主要原理是：以某组织或细胞的全部RNA或mRNA为模板，利用以3′端PolyA设计的锚定引物以及5′端任意引物进行逆转录反应和多聚酶链式反应(RT-PCR)，PCR扩增产物可在Sequence胶上显示该组织或细胞中的mRNA组成。被证实有差别表达的mRNA被回收，并重新扩增，扩增产物经克隆、测序后作为一个标记可被收入基因库并与基因库中的其他序列比较。该方法简便、灵敏，它能够快速地显示细胞mRNA的组成，可对各样本mRNA的差异同时进行比较和展示，并可立即进行cDNA测序、亚克隆、探针标记及文库筛选等工作；其缺点是假阳性条带多、对低丰度表达基因不易检测、基因克隆受mRNA表达时效影响、其扩增出来的条带常在基因3′端的UTR区，所提供的信息比较少。2.3差异显示分析或代表性差异分析(RepresentialDisplayAnalysis—RDA)由Lisitsyn等1993年发明，快速有效，可特异放大分化差异基因片段，具体思路如下：从实验组和对照组抽提RNA或mRNA，逆转录生成双链cDNA，将两种cDNA都用识别4碱基的内切酶Dpn充分酶切，加入R-24、R-12分子，退火连接之后除去多余的R-12分子后将cDNA分子补平，以R-24分子为引物，对照组与实验组cDNA进行PCR扩增，得到两个cDNA代表群。将这两个代表群分别用Dpn酶充分酶切后，在酶切之后在实验组中加入J-24/J-12接头分子，然后以1∶100的分子比与参照组混合杂交，除去多余的J-12分子，并用聚合酶将cDNA分子