会计学第一节核酸杂交的概念和原理（2）影响Tm值的因素：①DNA碱基组成：G-C含量越多，Tm值越高；②溶液的离子强度：低离子强度，Tm值较低，而且解链的温度范围较宽；高离子强度，Tm值较高，解链温度较窄。③pH值：溶液pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。④变性剂：各种变性剂主要干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。2、复性：变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程为DNA复性。核酸杂交技术就是利用DNA变性再复性的原理，进行的一项核酸检测技术。杂交分子可以在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合成的寡核苷酸单链与RNA或DNA单链之间形成杂交分子。二、核酸杂交的概念核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。通过将标记的已知核酸片段作为探针，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到样本核酸中相应的基因。根据检测对象和手段不同可将杂交枝术分为不同类型，常见的有四种类型Southern印迹杂交（DNA印迹杂交）Northern印迹杂交（RNA印迹杂交）原位杂交技术（insituhybridization）斑点及狭缝杂交(dotblothybridization)根据杂交体系的不同，核酸杂交可以分为液相杂交和固相杂交。固相杂交是将待测核酸先固定在固相支持物上，然后与溶液中的游离探针进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上。第二节核酸探针与标记二、探针的种类根据探针的来源和性质可分为：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等。选择探针的原则：1）要有高度的特异性2）容易制备3）灵敏性1、基因组DNA探针（最常用）为某一基因的全部或部分序列，但这些片段必须是特异的。制备：从基因文库选取某一基因片段，进行克隆后酶切获得。也可以应用聚合酶链反应（PCR）扩增DNA特定片段。优点：1）多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简单2）相对RNA而言DNA探针不易降解3）DNA探针标记方法较成熟。2、cDNA探针cDNA（complementary)是互补于mRNA的DNA分子。它是以RNA为模板，根据碱基配对原则，经逆转录酶（reversetranscriptase)催化合成的DNA。优点：不存在内含子和高度重复序列缺点：不易获得，限制了其应用。3、RNA探针mRNA探针是一类有特殊用途的核酸探针。优点：1）因是单链，所以与靶序列杂交效率高。2）因无高度重复序列，所以杂交特异性也高。缺点：1）易降解；2）标记方法复杂用途：1）可用于检测DNA和mRNA2）在研究基因表达时，常用于观察该基因的转录情况。4、寡核苷酸探针（人工合成）优点：1）可根据需要合成相应序列2）探针短，序列复杂性低，容易与靶点完全杂交。3）长度只有10～15bp，从而能降低杂交Tm值。4）可大量合成，使该探针价格低。三、探针标记物探针标记物的特性：1）具有高度灵敏性，高度特异性。2）标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基配对，也不影响探针的主要理化特性。3）检测方法假阳性率低，价格低，对环境污染少。4）若用酶促方法标记，应对酶的活性影响不大。（一）放射性同位素标记物（最常用）优点：检测特异性强，灵敏度高，对各种酶促反应无影响，，也不影响碱基配对。缺点：容易造成放射性污染常用同位素：32P，3H，35S也有用131I，14C在Southern印迹杂交中以32P最常用。32P主要以[α-32P]NTP或[α-32P]dNTP形式通过酶促反应掺入核酸探针，（二）非放射性标记物根据检测方法不同，分为：1、半抗原：生物素（biotin)和地高辛（DIG)较常用。半抗原与抗体进行免疫学检测。（较常用）2、配体：生物素还是亲合素（avidin)的配体。3、荧光素：如异硫氰酸荧光素（FITC)和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。4、化学发光探针：一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象。生物素-11-dUTP四、探针标记方法核酸标记可以在体内进行，也可以在体外进行。体外标记法分为化学法和酶促法。化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生化学反应将标记物直接连接到探针分子上。酶促法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中。1、切口平移法（nicktranslation)（最常用）用大肠杆菌的DNA聚合酶I将DNA分子的一条链上随机切开若干切口（nick)，切口处形成3′-OH末端再在DNA聚合酶I的催化下，在切口3