核酸分子杂交及芯片技术1、变性(denaturation)在一定得条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。无共价键断裂。2、融解温度(Tm值):在DNA热变性时,其A260得升高达最大值一半时得温度。影响Tm得因素:(1)DNA碱基得组成G-C含量越多Tm值越高A-T含量越多Tm值越低(2)溶液得离子强度低离子强度Tm值越低高离子强度Tm值越高3、复性变性DNA经过一定处理通过碱基互补重新形成双螺旋得过程。可逆性(非共价结合)序列特异性(碱基互补配对)4、杂交教学内容大家学习辛苦了，还是要坚持一、概念探针(probe)指能与特定靶分子发生特异性相互作用,并能被特殊方法所检测得分子。例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成就是探针与靶分子得相互作用。核酸探针指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交,杂交后又能被特殊方法检测得已知被标记(同位素或非同位素标记)得核苷酸链。二、分类根据性质和来源不同:(1)基因组DNA探针有内含子,杂交效率低(2)cDNA探针无内含子,适用于基因表达得检测(3)RNA探针单链性,特异性高;不稳定,易降解(4)寡核苷酸探针合成方便,灵敏度受长度限制稍差二、分类根据标记方法不同:(1)放射性探针(2)非放射性探针理想得核酸探针标记物应具备①高度得敏感性②标记物与探针结合后,不影响杂交时碱基配对及探针分子得主要理化性质;③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性率低外,尚需考虑环境污染少,价格低;④若用酶标记,应对酶得Km值影响不大,以保证标记反应得效率和标记产物得比活性。(一)标记物放射性同位素标记物非放射同位素标记物1、放射性常用得有32P/35S/3H。特点:检测得灵敏度和特异性高射线对人体有伤害放射性物质需特殊得处理半衰期短不宜存放使用2、非放射性标记物常用得有地高辛(digoxigenin,Dig)、生物素(biotin)、荧光素、酶。特点:敏感性不如同位素标记稳定性高、检测时间短操作简便不需特殊得防护设备不存在放射性污染(二)标记法1、随机引物法(randompriming)利用DNA聚合酶来合成与模板互补得新得DNA链。将6-8寡核苷酸片段与已变性得DNA单链或RNA模板退火,使该片段随机互补结合在单链分子上,在大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段作用下,以同位素标记得dNTP为原料,寡核苷酸为引物得3’-OH端开始沿5’至3’方向,合成一条与模板互补得新DNA链。随机引物(6-8nt):含有各种可能排列顺序得寡核苷酸片段得混合物。46=409648=655362、切口平移法◆胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口,切口处形成3’-OH末端。◆大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用,以另一条DNA链为模板。◆4种三磷酸脱氧核苷酸为原料,沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行,切口平行推移。生成得两条链都被同位素均匀标记。大肠杆菌DNA聚合酶I得活性种类？大肠杆菌DNA聚合酶I(1)5’3’聚合酶活性(2)3’5’外切酶活性(3)5’3’外切酶活性3、末端标记法末端标记法就是将标记物导入线型DNA或RNA得5’端或3’端得一类标记法。5’端标记法3’端标记法(1)5’端标记法(T4多聚核苷酸激酶)用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端得磷酸基团,使其成为5’-OH,然后在(γ-32P)ATP存在下,经T4多聚核苷酸激酶催化,将γ位上得32P转移到DNA或RNA分子得5’-OH末端,使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带32P标记。(2)3’端标记法(大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段)大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱得3’→5’外切酶活性,但无5’→3’外切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。教学内容核酸分子杂交↓固相杂交液相杂交膜上印迹杂交核酸原位杂交一、膜上印迹杂交1、固相支持物得选择2、印迹方法MethodsoftransferCapillaryBlotting(upward)nospecialequipmentrequired!ElectrophoreticblottingVacuumblotting3、印迹类型提取DNASouthern印迹杂交得应用:Northern印迹杂交应用DNA探针检测特异mRNA得一种杂交技术,主要用于分析mRNA得转录或mRNA分子大小,其方法类似于Southern印迹杂交。优点:简单、迅速(直接点样);可在同一张膜上进行多个样品得检测;应用:同一种样品经不同倍数得稀释,可以得到半定量得结果;核酸粗提样品得检测效果也较好。检测得就是基因组DNA还就是mRNA?Colonyorphagehybridization从重组DNA文库中筛选阳