pET原核表达—问答篇eeflying：原核表达系统中，哪种载体最好？原核表达没有最好，可以说一般都是在碰，和你要表达蛋白的性质有关，也和你表达后的用途，及因此而选择的表达策略有关。比如，１。你是否介意有亲和标签，亲和纯化当然纯化相对容易，但有时亲和标签的存在会影响蛋白的功能，２。如果用亲和标签，用什么亲和纯化策略，his或GSH还是染料抑或是IgG-ProteinA亲和，LAB的IMPAC-TWIN,还是别的如转铁蛋白等，亲和层析的策略也有很多，３。最终产物是否有必要将亲和标签去掉，如用蛋白酶切掉标签，或IMPAC-TWIN会自己切掉，用因子X切掉HIS,4。表达的部位，是可溶性表达还是包涵体表达，是周质表达还是分泌表达还是分泌表达。５。是否加入开关诱导、或是加入IPTG诱导噬菌体T7系统。６。你表达的蛋白质是否会与细菌内某些蛋白相互作用而致表达失败。７。如果不用亲和标签，纯化用什么方法纯化？８。即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。９。载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。１０。蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。YONG:原核表达系统中，哪种载体最好？载体没有最好，看哪一种最合适你的实验目的。这几年新发展的载体一般具有下列特点的一个或多个：1）更多的融合标签选择（提供多种亲和纯化方便）2）严紧的表达调控，更低的渗漏表达3）分子伴侣蛋白，促进折叠和可溶性表达此外，具有更好的质粒稳定性并能够纠正遗传密码偏爱的新的蛋白酶缺陷的宿主细胞也是一个很好的工具。最新的不一定是最好的，pBV220经常可以给出不错的表达，虽然多半是包含体。YONG:关于表达载体不同的载体的特点不同，主要的差别有启动子类型，质粒拷贝数等，基因本身的因素基因5’非编码区的二极结构，密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。现在还没有谁可以用大肠杆菌成功表达每一个基因，尤其是使用指定的表达系统更是不可能。根据研究的目的以及基因和载体的特点选择表达系统，说说容易，做起来很难。SDS-PAGE所显示的不表达很多情况下是低表达，尤其是当目的蛋白迁移率与菌体中某种丰富蛋白一致时，不高的表达带常被遮盖。Westernblotting的灵敏度高，可以用来检测很低的表达。对于某些研究来说，表达是为了在细胞内提供某种功能，不需要高表达；更多的情况是把大肠杆菌作为制备重组蛋白的细胞工厂，此时表达量具有重要意义，低表达为蛋白纯化带来困难，对于某些研究或开发来说，低表达意义不大。当然，通过westernblotting检测可以排除一些基因表达中的不确定或待确定因素，而且某些时候即使是高表达，westernblotting也是蛋白定性的重要指标。YONG:请教-pET表达我试着说一下：1）如何获得非融合高效表达？高效的非融合表达很多情况下是大肠杆菌表达最愿意看到的结果，如果是可溶性的，可能会让大部分研究者更加兴奋。但理想和现实是有差距的。凭心而论，你做的还是不错的，毕竟看到了高效表达，虽然是包含体，虽然信号肽的切割情况不明，毕竟你可以拿到东西了。可以试一下包含体的复性和纯化，测测活吧！否定一个信心苦苦得出的结果要慎重呀！下面讨论一下如何实现更高的追求：首先是老生长谈，影响大肠杆菌表达的因素：遗传密码偏爱性、mRNA5'二级结构、第二密码子等，参见各种综述和论坛中的帖子。融合表达优化了上述影响表达的因素，所以更容易成功。很多药用蛋白的表达也采用了融合表达策略，可能是无奈的选择，也可能是为了获得可溶性表达或为了获得有利于初步纯化的性质并成功的解决了酶切或化学切割融合头后目的蛋白的纯化。IL-11就是这样的例子。所以非融合表达并不是一无是处，关键看有没有办法达到最后的目的。如果是药用蛋白，准备申报临床，最好保持天然的N-末端，所以蛋白酶或化学切割要非常特异，不要再N端引入新的氨基酸或导致目的蛋白N端不整齐。非融合表达的N端的Met一般是报批容许的，虽然这不是天然的形式。非融合表达省略了切割融合头的步骤和切割后的纯化步骤，具有成本优势。非融合表达的实现首先需要分析，其次看运气，有时运气因素更多。尽可能把影响基因表达的因素都考虑到并逐个优化要花费很大的精力，但这并不能保证这种优化一定会得到理想的结果，未知的因素和因素之间的作用使得完美的优化方案非常难实现，而且基因本身的因素也不允许随心所欲的优化（比如氨基酸序列不能任意改变）。原核表达的特点就是时间短、花钱少，所以多方案