不同温度对细胞骨架的影响【摘要】：细胞骨架是维持细胞生命活动非常重要的结构成分,狭义上主要是指细胞质骨架,其装配和解聚受酸碱度、温度和钙离子浓度等多种因素的影响。本文使用显示细胞骨架最常用的考马斯亮蓝染色法初步探讨了酸碱度和温度对细胞骨架的影响程度。试验结果表明,不适当的酸碱度和温度都会导致细胞骨架的解聚,光镜下呈现不同程度的云雾状和空泡状,云雾状多出现在酸碱处理组,而空泡状多出现在温度处理组。【作者单位】：龙岩学院生命科学学院;10生物技术【关键词】：细胞骨架考马斯亮蓝酸碱度温度目的原理，材料，方法，预测结果，参考文献，设计依据一、实验目的通过本实验的学习，了解在体外，温度对细胞骨架系统装配的影响，训练学生如何设计实验步骤来验证书本的知识点，使知识点掌握得更牢固，从而培养学生动手操作能力，独立思考问题，并通过查阅资料解决问题的能力，为今后遗传学的学习、毕业论文的完成等奠定基础。二、实验原理细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。一些细胞骨架系统的装配和去装配在时间和空间上是高度有序的，在体外，它们在温度因素的作用下，可进行装配或去装配过程。考马斯亮蓝法显示细胞骨架的原理1、蛋白质的细胞化学：（1）蛋白质是细胞中重要的结构和功能成分，某些染料能与蛋白质的氨基酸残基结合，产生颜色反应，借以对蛋白质进行显示。这种对蛋白质直接染色的细胞化学方法并不多，特异性也不强。（2）目前，应用最广泛的方法是利用免疫标记技术对蛋白质进行特异性显示，通过荧光标记细胞骨架成分的单克隆抗体对细胞骨架蛋白进行显示。2、细胞中的细胞骨架成分：（1）、细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。（2）、细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。温度对细胞骨架影响的原理;温度处理导致解聚的骨架蛋白分布于胞质边缘，解聚后微丝蛋白重排，胞质内出现大面积，大小不一的空泡。经过一段时间不同温度的处理，细胞核有变小的趋势，从何细胞骨架也有影响。三：主要仪器、试剂实验用品(1)材料洋葱内表皮(2)器材显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计。普通冰箱、低温冰箱、培养箱，恒温水浴锅。四个培养皿，刀片，镊子(3)试剂1.0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3）50ml0.15mol/LNaCl双蒸馏水加至1000ml2.PB0.2mol/LNa2HPO477ml0.2mol/LNaH2PO423ml3.M-缓冲液咪唑(PH6.7)50mmol/LKCl50mmol/LMgC120.5mmol/LEGTA1mmol/LEDTA0.1mmol/L巯基乙醇1mmol/L甘油4mmol/L用1mol/LHCl调pH至7.2。4.1%的TritonX-100/M-缓冲液5.0.2%考马斯亮蓝R250染液甲醇46.5ml冰醋酸7ml蒸馏水46.5ml6.3%戊二醛-PB溶液（PH7.3）四：实验方案步骤一：温度处理方法撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于4个培养皿中,分别在-18℃冰箱、4℃冰箱、50℃培养箱和20℃(对照)中处理1h。步骤二：细胞骨架的制片与观察首先将洋葱片放入装有pH值6.8磷酸缓冲液的小玻璃瓶中，使其下沉；然后吸去磷酸缓冲液，用1%TritonX-100处理25min（抽提骨架以外的蛋白质）；吸去TritonX-100后，用M-缓冲液洗3次，每次3min，洗涤的同时可以稳定细胞骨架；再用3%戊二醛固定15min；吸去戊二醛后，用PBS洗3次，每次3min；用0.2%考马斯亮蓝R250染色15min；用蒸馏水洗涤2次；取出洋葱鳞茎内表皮，展平在载玻片上，空气干燥；最后镜检。（1）、洋葱表皮细胞取材后，用PBS液轻轻漂洗。（3次，3min/次）（2）、用1%TritonX-100/M缓冲液处理15min（30min），室温或者37℃均可。（3）、M缓冲液轻轻洗细胞3次（3-5min/次），M缓冲液有稳定