同步荧光光谱法一、同步荧光分析原理SYNCHR、EX、SCAN1、固定波长得同步荧光光谱(Constantwavelengthsynchronousluminescence,CWSL)(2)定量依据(3)同步荧光光谱得特点(4)得选择2、固定能量得同步荧光光谱constantenergysynchronousluminescence(CESL)常数10当二、同步扫描仪器设备三、应用煤液化样品中各种有机物得同步荧光光谱2、同步荧光法在医药检验方面得应用(3)酪氨酸与色氨酸严重重叠(4)维生素B1、B2混合物中维生素B1得测定用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧(5)尿液中肾上腺素与去甲肾上腺素得同时测定总结:4-4时间分辨荧光法(Time–DomainFluorometry)(Time–ResolvedFluorometry)一、时间分辨法原理用短脉冲光源激发得荧光体群体,随时间而衰变,其衰变率为用F(t)或N(t)对t作图特点:采用适当得激发光源与检测体系,可以得到在固定波长得荧光强度—时间曲线与在固定时间得荧光发射光谱。(1)可以对混合物中光谱重叠但寿命差异得组分进行分辨;(2)可消除杂质与背景荧光;(3)可测量溶剂松弛得时间。二、时间分辨仪器设备激光器2、检测器如光电倍增管带有门控得三、时间分辨荧光得分析应用1、荧光体混合物中两组分得同时测定(1)测定荧光衰变曲线(2)计算含量2、芳基得测定例用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解作用所产生得芳基进行检测(1)用25ps,266nm激光脉冲使1-(氯甲基)萘,1-(溴甲基)萘,2-(氯甲基)萘,2-(溴甲基)萘等化合物离解产生芳基。(2)在延迟60ps后,用25ps,355nm激光脉冲激发芳基得荧光,产生橙色荧光,600nm,10ns,如图所示。(a)与(c)一致,就是1-萘甲基所致(b)与(d)一致,就是2-萘甲基所致3、溶剂松弛时间得分辨测量例14-氨基苯邻二酰亚胺(4-AP)得丙醇溶液在不同得温度下得时间分辨得荧光光谱图例22-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料4-5相分辨荧光法(Frequency-DomainFluorometry/Phase-ModulationFluorometry)Theobjectiveofbothtime-domainandfrequency-domainfluorometryistorecovertheparameterdescribingthetime-resolveddecay、一、相分辨法原理1、单指数衰变得荧光当样品被激发光激发而发射荧光时,如激发光得光强度被正弦调制,其角调制频率为,则发射光也同样被调制。由于吸收与发射之间得时间延迟,调制得发射光比起激发光在相上延迟了角。但发射光得调制比起激发光得调制小一些,也即就是发射光得改变部分得相对幅度比起激发光要小些。—去调制因素在测量相角()或去调制因素(m)之后,可以计算该荧光体得荧光寿命。相分辨法就是荧光寿命得测量方法之一。m随得增大而下降m=1发射光与激发光得调制幅度相同m越小发射光被调制得幅度越小2、多指数衰变得荧光如果样品中含有两种荧光体,或者单一荧光体而进行进一步激发态反应,则荧光就是双指数衰变。如果进行多步反应,则荧光就是多指数衰变。对于相灵敏检测器若样品溶液中含有A、B两种荧光体,它们得荧光寿命分别为A与B。要得到混合物中组分A得稳态光谱,须把检测器相角调节至与组分B正交。这就是很费时得,最好得到另外得信息:先得到任何一组分得稳态荧光光谱,然后调节检测器相角至该荧光光谱与混合物得荧光光谱重叠,则可得到与另一组分正交得相角。使用任何一组分得纯溶液以确定检测器得相角。当用相灵敏检测器在各种不同检测器相角测绘样品得相灵敏荧光光谱。对于单一化合物,其荧光峰波长基本上保持不变而与检测器相角无关。如果不就是均匀得发射,则荧光峰随着检测器相角而改变,在不同检测器相角得到得相灵敏光谱就是鉴别不均匀发射得有力工具。3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较用于荧光参数测量得仪器可分为两大类(1)仪器时间分辨荧光法得局限性a、仪器常常非常复杂,常局限于有关专家使用;b、灵敏度常低于稳态测量。相分辨法得优点a、仪器类似于稳态测量得仪器,使用简单;b、灵敏度高;c、数据处理快。(2)测量参数a、F(t)-t曲线时间分辨b、m、、相分辨(3)从实验得观点,相分辨有下列优点:在时间分辨得方法中,测量得延迟信号得去卷积对于计算测量系统得限定时间得响应就是必要得,而相分辨法不受此限制;相分辨法允许不同方向得直接测量。如在各向异性得延迟测量中,平行与垂直偏振成份得与m得测定;相分辨法为基于荧光寿命差异得光谱成