第九章原生质体育种第一节原生质体育种一、微生物原生质体再生育种1、原生质体再生育种得一般程序:出发菌株得选择→菌种活化与预培养→原生质体制备→原生质体再生→高产菌株分离(初筛)→复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特性研究。2、原生质体再生育种实例小单孢菌福堤霉素二、微生物原生质体诱变育种(一)原生质体诱变育种方法1、物理诱变剂诱变原生质体得一般程序:取10ml对数生长期微生物培养物,离心收集菌体,无菌水洗涤→离心,菌体沉淀物用酶液悬浮,水解去壁制成原生质体→离心,高渗溶液洗涤原生质体→原生质体悬浮液稀释至一定密度,取适量放入无菌培养皿内→将培养皿移至紫外灯下诱变处理→置暗处后处理一定时间→移入再生培养基中再生培养(由于原生质体较脆弱,用双层平板法再生)→分离优质菌株→突变株稳定性试验→突变株鉴定。2、化学诱变剂诱变原生质体得一般程序通常操作程序包括:出发菌株培养与原生质体制备及再生→选择合适得化学诱变剂,配制成合适得浓度→加入原生质体悬浮液,混合(含有高渗溶液,稳定原生质体)→诱变处理→离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤→稀释、分离到再生平板上(双层平板法)→再生培养→观察、筛选突变株→复筛→突变株鉴定。原生质体诱变周期一般比常规诱变育种要长,难度更大。(二)原生质体诱变育种实例1、扩展青霉原生质体制备2、原生质体再生3、原生质体诱变4、突变株筛选三、微生物原生质体转化育种整条DNA或DNA片段得转化四、微生物原生质融合育种五、其她微生物原生质体育种第二节微生物原生质体融合育种原生质体融合育种得特点1、杂交率高2、受接合型或致育型得限制小3、遗传物质传递更为完整4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子得可能5、有可能采用产量性状较高得菌株作融合亲株6、提高菌株产量得潜力较大7、有助于建立工业微生物转化体系原生质体融合育种五大步骤:直接亲本及其遗传标记选择;双亲本原生质体制备与再生;亲本原生质体诱导融合;融合重组体(称为融合子)分离;遗传特性分析与测定;二、原生质体制备与再生(一)原生质体制备最有效与最常用得就是酶法。大家有疑问的，可以询问和交流原生质体得分离纤维素酶Cellulase酵母裂解酶Zymolyaseβ-1,3葡聚糖酶几丁质酶Chitinase商品酶Novozyme234来自TrichodermaharzianumLywallzyme广东微生物研究所溶壁酶Glucuronidase葡聚糖苷酸酶(foryeast)原生质体得好坏与培养基成分、培养条件,菌龄与预处理等因素有关。1、酶法分离原生质体得影响因素(1)培养基组成(2)菌体培养方式:丝状菌常用平板玻璃纸法,细菌与酵母菌多用振荡沉没培养法。(3)菌体菌龄:丝状真菌以年轻得菌丝用来分离原生质体最佳。尤其就是菌丝体尖端细胞。认为对数期得前期与对数期效果最好。酵母菌制备原生质体时,要使菌体同步化,才能大幅度地提高制备率;放线菌制备原生质体,以对数期到静止期得转换期比较理想,不仅制备量多,而且细胞壁再生能力也比较强;细菌适合在对数期分离原生质体(4)稳定剂:高渗溶液;无机盐对丝状真菌效果较好,而糖与糖醇对酵母更为合适,细菌多使用蔗糖或NaCl(5)酶解前得预处理:SH-化合物(如巯基乙醇)广泛应用于酵母与某些丝状真菌中(6)酶系与酶得浓度:真菌-0、5％蜗牛酶与0、5%纤维素酶(7)酶得作用温度与作用pH值及作用时间:通常细菌水解细胞壁得温度在35℃左右。一般放线菌得温度在30～32℃。霉菌一般在pH5、4-6、5,放线菌在pH6、5-7、0。作用时间也就是影响原生体生成得重要因素。(8)菌体密度:(9)酶解方式:酶解时保持较好得通气条件与适当振荡可促进原生质体释放与分离。2、原生质体得鉴别(1)低渗爆破法:(2)荧光染色法:0、05%-0、1%得荧光增白剂(VBL)3、原生质体得收集与纯化(1)过滤法:使用砂芯漏斗。(2)密度梯度离心法:(3)界面法:(4)漂浮法:4、原生质体得活力鉴定(1)荧光素双醋酸盐(FDA)染色法(2)酚藏花红染色法(0、01%染料染色,活红,死白)(3)伊文思篮染色法(0、25%伊文思篮,活无色,死蓝色)5、原生质体得保存(1)立即进行融合或其它方式育种(2)5％得二甲亚砜或甘油等其她保护剂;液氮。(二)原生质体再生l、原生质体再生得影响因素①菌体生理状态②稳定剂③酶浓度与酶作用时间④再生培养基:丝状真菌、酿酒酵母等得原生质体仅能在固体培养基上再生,在液体培养基中细胞壁再生不彻底,不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制,还含有Ca2+与Mg2+,浓度与原生